埃博拉病毒疫苗的研究進展

王寅彪 王利平 李鵬

1 前言

2014年暴發的埃博拉病毒病（EVD）給西非多國造成了重大人員傷亡和經濟損失，并在英國和美國等國家本土出現感染病例，被WHO 稱為“聯合國成立以來最嚴重的公共衛生危機”。EVD 又稱埃博拉出血熱，是由埃博拉病毒（EBOV）感染人或非人靈長類動 物（NHP）引起的一種烈性傳染病，病死率高達90%，感染者以出血、發熱、低血壓、多臟器受損等為主要臨床表現。EBOV 與馬爾堡病毒（MARV）同屬于絲狀病毒科，為有囊膜的單股負鏈RNA 病毒，其基因組大小約19 kb，編碼7 種蛋白：核蛋白（NP）、VP35、VP30、L、糖蛋白（GP）、VP40 和VP24 蛋白。根據發生地和抗原特性不同，EBOV可分為：扎伊爾型（ZEBOV）、蘇丹型（SUDV）、本迪布焦型（BDBV）、塔伊森林型（TAFV）和雷斯頓型（RESTV）；除了RESTV對人不致病外，其余4 種EBOV 感染均可導致人發病，其中ZEBOV 和SUDV 對人有致死性。EBOV 的GP蛋白在病毒囊膜表面形成三聚體，介導病毒入侵宿主靶細胞，是誘導中和抗體產生的重要蛋白，幾乎所有EBOV 候選疫苗均使用GP 蛋白作為免疫原。

2 EBOV 疫苗

現有的EBOV 疫苗有DNA 疫苗、重組亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗及病毒載體疫苗等。常用的評價EBOV 疫苗效力的小型實驗動物模型有小鼠、豚鼠和敘利亞金黃地鼠，非人靈長類動物（NHP）模型有恒河猴、獼猴和狨猴。當前對于EBOV 感染的免疫清除機制尚不清楚，也無明確的保護性指標。疫苗免疫后，通常利用結合實驗檢測抗體與重組蛋白或與滅活病毒粒子的結合能力對體液免疫水平進行評價，利用病毒中和試驗測定抗體的中和活性；細胞免疫水平一般通過細胞內細胞因子染色法（ICS）或酶聯免疫斑點檢測（ELISPOT）測定病毒抗原特異性細胞因子或分泌特異性細胞因子的細胞頻率進行 評價。

2.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗采用在體內表達外源基因的方式可模仿病毒感染，誘導體液免疫應答和細胞免疫應答的產生。使用表達GP 或NP 蛋白的DNA疫苗進行3～4 次免疫（1.5 μg/次）可保護小鼠免受致死劑量EBOV 攻毒。表達GP 蛋白的多價絲狀病毒疫苗可保護小鼠和豚鼠免受致死劑量EBOV 和MARV 的攻毒，該疫苗可誘導產生顯著的殺傷性T 淋巴細胞（CTL）應答。在NHP 免疫實驗中，肌肉電轉（500 μg/次）表達GP 蛋白的質粒3 次可誘導獼猴體內產生高水平的中和抗體并保護其抵抗致死劑量EBOV 攻毒（5/6）。使用表達GP 或NP 蛋白的DNA 疫苗進行的I期臨床試驗表明DNA 疫苗安全性高，免疫原性良好，能誘導機體產生GP 或NP 蛋白特異性抗體及特異性CD4+T 和CD8+T 細胞免疫。雖然DNA 疫苗可量產，而且產生的副反應較輕，但需要進行多次免疫才能起到相應的保護效果。

2.2 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗具有純度高、安全性好等特點，可使用原核（如大腸桿菌）和真核（如桿狀病毒）等表達系統進行大量制備，其免疫效果受免疫次數、佐劑類型等影響較大。PHOOLCHAROEN 等利用在本生煙草中表達的EBOV_GP1 蛋白及其單抗復合物與不同的佐劑混合對小鼠進行4 次免疫獲得了80%以上的保護率，且發現IgG2a 與保護率非常相關，與之前研究發現給小鼠被動免疫IgG2a 單抗可對EBOV 攻毒起到保護作用的結果一致。KONDURU 等使用CHO細胞表達了EBOV GP 蛋白胞外區與人源IgG1Fc段的融合蛋白作為疫苗免疫小鼠4次，誘導產生了GP 蛋白特異性的T細胞應答及中和抗體，并能夠保護小鼠免于致死劑量EBOV 攻擊（7/8）；而且，此融合蛋白可形成同源三聚體，與天然病毒粒子上的GP 蛋白結構類似，具有用作安全、高效的亞單位疫苗的潛力。KONDURU 等同樣利用豚鼠實驗測試了GP-Fc 疫苗的免疫效力，發現以Poly-ICLC 作為佐劑時，能夠100%保護豚鼠免于致死劑量EBOV 攻毒，而且發現以此種亞單位疫苗免疫豚鼠后產生的GP蛋白特異性抗體水平與保護率之間并無相關性。相對于GP 蛋白而言，VP24 和VP40 蛋白在絲狀病毒中的保守性非常高，適用于通用疫苗制備，而且VP24 和VP40 蛋白能夠誘導細胞免疫應答，從而增強宿主的保護性免疫應答。LEHRER 等使用果蠅 S2 細胞共表達了 EBOV 的GP、VP24 和VP40 蛋白，該疫苗在小鼠體內免疫原性非常強，能夠100%保護小鼠免于致死劑量EBOV攻毒，即便在未使用佐劑的情況下進行3 次免疫后也能獲得70%的保護率。

2.3 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒疫苗（VLP）是不含病毒核酸，形態類似于天然病毒粒子的一類疫苗，具有安全性好，免疫原性高等優點，能夠被APC 細胞高效識別，刺激免疫應答產生，已在HIV 病毒、HBV 病毒、HPV 病毒、流感病毒、MARV 病毒疫苗研制中進行過測試。WARFIELD 等向HEK 293T 細胞中共轉染表達EBOV GP 蛋白、VP40 蛋白和NP 蛋白的質粒制備了VLP 疫苗，免疫后對小鼠、豚鼠、獼猴均提供了100%保護率；而且，共表達EBOV 的GP 蛋白與MARV 的VP40 蛋白或共表達EBOV的VP40 蛋白與MARV 的GP 蛋白時，均能形成VLP，為制備抗絲狀病毒的通用疫苗提供了依據。VLP疫苗免疫同樣受佐劑類型影響，使用模式識別受體PRR 的激動劑作為佐劑時，可有效提高疫苗效力。BENGTSSON 等利用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統表達了EBOV 的GP 蛋白，純化后GP 蛋白形成了30～40 nm 的顆粒，與Matrix-M 佐劑混合免疫小鼠3 次后對致死劑量EBOV 攻毒提供了100%保護率，而使用Al-PO4 作為佐劑時則無保護性，單獨使用GP 蛋白免疫后保護率為10%，而且Matrix-M 佐劑組的小鼠能夠迅速產生GP 蛋白特異性IgG及中和抗體，骨髓中GP 蛋白特異性B 細胞持續周期更長，分泌GP 蛋白特異性IFN-γ 的T 細胞數量更多。

2.4 病毒載體疫苗

用于EBOV 疫苗制備的病毒載體有：腺病毒（rAdv）、痘病毒（MVA）、水皰性口炎病毒（VSV）、復制型人副流感病毒（HPIV）、狂犬病毒（rRABV）、巨細胞病毒（CMV）、基于委內瑞拉馬腦炎病毒（VEE）的RNA 復制子（VRP）等。在美國、歐洲及非洲進行臨床測試的EBOV 疫苗均以GP 蛋白為靶標，其中一些采用單針免疫，一些采用2 次免疫（首免＋加強免疫不同的疫苗，heterologous prime-boost approach），2 次免疫比單針免疫免疫效果更好，但2 次免疫的推廣受限于EBOV 流行地區的經濟條件及后勤運輸保障等因素。而且，EBOV病毒載體疫苗因使用的載體和測試動物不同，產生的免疫應答的情況各異。VSV 載體疫苗免疫NHP 后產生的體液免疫應答對保護至關重要，細胞免疫應答在單針rAdv 載體疫苗免疫后產生的免疫保護中至關重要。體液免疫及細胞免疫均對NHP抵抗EBOV 感染具有保護作用，人體自然感染EBOV 后也能夠同時產生體液免疫和細胞免疫，因此，良好的EBOV 疫苗應能夠同時誘導產生較長持續周期的細胞免疫力和抗體水平。

2.4.1 基于腺病毒載體的EBOV 疫苗LEDGERWOOD 等制備了表達GP 蛋白的人腺病毒5 型載體疫苗（rAd5-GP），并進行了單針免疫臨床測試，該疫苗安全性較好，但免疫效果受機體內腺病毒預存抗體的制約而使得GP 蛋白特異性抗體滴度較低。增加免疫劑量雖然能夠克服這一缺陷，但與此同時也增強了副反應，而且預存的5 型腺病毒抗體能夠增加受試者感染HIV 的風險。基于復制缺陷型黑猩猩3 型腺病毒載體制備的 EBOV 疫苗（ChAd3-GP）于2014—2016年分別在美國、英國、瑞士及非洲馬里開展了 I期臨床測試：單針免疫該 疫苗在受試者體內產生了顯著的體液免疫應答及細胞免疫應答，且抗體水平持續6個月依舊明顯，該疫苗產生的副作用較輕，安全性較好，同時減少了預存抗體的干擾。我國研究人員制備了表達2014 基因型EBOV 流行株GP 蛋白的rAd5 疫苗，已在我國及塞拉利昂健康成人中進行了I期和II期臨床試驗，單次免疫8.0×1010個病毒粒子可誘導GP蛋白特異性抗體及細胞免疫應答的產生，且為凍干型，常溫下可穩定 熱帶地區使用。

2.4.2 基于MVA病毒載體的EBOV疫苗改良型痘苗病毒安卡拉株載體（MVA）是一種復制缺陷型病毒載體，已被用于天花、瘧疾、流感及結核疫苗研發。表達EBOV 病毒GP 蛋白的MVA（MVAGP）疫苗 免疫豚鼠后僅提供了部分保護，3 次免疫獼猴之后，動物均出現了病毒血癥。因此，當前MVA-GP 疫苗主要被用作加強免疫。ChAd3-GP 免 疫NHP 后可在短期內對EBOV 攻毒感染提供100%免疫保護，然而要想10個月后仍獲得完全保護，則需要使用MVA-GP 疫苗作加強免疫。鑒于這種首免+加強免疫的策略在臨床前試驗中提供的超強保護持續期，一些I期臨床試驗在人群中測試了這一方案。與ChAd3-GP 疫苗單針免疫相比，使用ChAd3-GP 首免，2～3個月后加強免疫表達EBOV、SUDV 及MARV 病毒GP 蛋白及TAFV 病毒NP 蛋白的重組MVA 載體疫苗在人體內獲得了更好的安全譜，顯著增強了細胞免疫應答及體液免疫應答。

2.4.3 基于VSV 病毒載體的EBOV疫苗重組水皰性口炎病毒（VSV）能夠有效遞送外來抗原，已在HIV病毒、流感病毒、丙肝病毒和乙肝病毒等疫苗研制中得到應用，而 且機體內預先存在VSV 病毒抗體的可能性較小。對NHP 單針肌肉注射1×107pfu 的rVSV-GP（ZEBOV）疫苗28 d 后，能夠保護其免受致死劑量的同源ZEBOV 病毒（1000 pfu）的攻擊，但對SUDV 攻毒無交叉保護，對rVSV-GP 誘導保護的機制進行研究后發現抗體應答在保護中不可或缺，而且抗體水平與保護率直接相關。另外，肌內免疫rVSV-GP（ZEBOV）疫苗后可保護以氣溶膠方式進行的ZEBOV 攻毒，而且通過鼻腔或口腔黏膜免疫該疫苗也可保護以肌肉注射進行的ZEBOV攻毒，表明黏膜免疫同樣在rVSV- GP（ZEBOV）疫苗免疫后產生的保護中發揮重要作用。最近一項研究表明使用rVSV-GP 疫苗免疫NHP 7 d 即可為致死劑量ZEBOV 攻毒 提供100% 保護，因此，該疫苗可用于保護一線醫療救護人員及受感染威脅的社區，從而在早期減少疫情的擴散。GEISBERT 等則利用rVSV表達了多種絲狀病毒的GP 蛋白，混合制備了通用疫苗，免疫NHP 后可保護動物同時免受EBOV（ZEBOV，SUDV，TAFV）及MARV 感染。

2.4.4 基于副黏病毒載體的 EBOV疫苗人3 型副流感病毒（HPIV-3）是一種引起兒童下呼吸道感染的副黏病毒（paramyxovirus）。單次鼻腔內免疫表達EBOV 病毒GP 或NP蛋白的重組人3 型副流感病毒疫苗（rHPIV3/ZEBOV-GP 或rHPIV3/ ZEBOV-GP/NP）可以保護豚鼠免受致死劑量EBOV 病毒攻擊，通過呼吸道途徑2 次免疫恒河猴也可提供100%保護。MEYER 等對比了通過呼吸道途徑免疫氣溶膠形式的rHPIV3/ZEBOV-GP 疫苗、液體形式的rHPIV3/ZEBOV-GP 疫苗及肌肉免疫表達GP 蛋白的委內瑞拉馬腦炎病毒（VRP-GP）產生的免疫應答，發現氣溶膠形式的rHPIV3/ZEBOV- GP 疫苗誘導產生了更高水平的血液和黏膜IgG、IgA 及中和抗體，更強程度的CD4＋T 細胞應答，而且單次氣溶膠疫苗免疫為獼猴提供了100%保護率。雖然呼吸道免疫rHPIV3 載體疫苗可使受試者免于針注，但其免疫效果可能受到體內預存抗體的影響。

2.4.5 基于其他病毒載體的EBOV疫苗BLANEY 等制備了表達EBOV 病毒GP 蛋白的重組狂犬病毒疫苗（rRABV/ZEBOV-GP），這種2 價疫苗免疫可同時預防狂犬病毒及EBOV 的感染，單次免疫即可對致死劑量EBOV 攻毒提供100%保護，而且保護作用與抗體應答相關，其中IgG1 型抗體應答在免疫保護中起重要作用。

巨細胞病毒（CMV）可在其宿主群體中重復感染與傳播，不受預存免疫力的影響。TSUDA 等制備了表達ZEBOV 病毒NP 蛋白CTL 表位（43-54 aa）的重組CMV 疫苗，單次免疫該疫苗后，較快誘導產生了此表位特異性的CTL 應答，2 次免疫小鼠后，可使其經受住致死劑量EBOV 攻毒，但體內仍存在EBOV病毒復制，這一結果表明CTL 應答在免疫保護中起重要作用，但需要在其他動物模型上進行更多驗證。

PUSHKO 等基于委內瑞拉馬腦炎病毒（VEE）制備了RNA 復制子疫苗（VRP-GP 及VRPNP），單獨免疫VRP-GP 或與VRP-NP 同時免疫能夠對小鼠和豚鼠起到保護作用，僅免疫VRP-NP 只保護小鼠，不保護豚鼠，研究未發現抗體水平與保護率之間的相關性。HERBERT 等 發現單次經肌肉注射VRP-SUDV-GP與VRP-ZEBOV-GP能夠完全保護獼猴免受致死劑量ZEBOV 或SUDV攻擊。

3 研究展望

當前已進入臨床測試的EBOV疫苗有DNA 疫苗、rAd5 疫苗、ChAd3疫苗及rVSV 疫苗。DNA 疫苗免疫原性稍弱，需要進行多次免疫；rAd5疫苗可受預存抗體的干擾，需要使用較高的劑量予以克服；ChAd3 疫苗免疫可在短期內提供較好保護，但持續期有待延長，故多采用ChAd3疫苗進行首免，MVA 疫苗作加強免疫；rVSV 疫苗能夠在10 d 內誘導產生免疫保護，仍需更多臨床測試來確定免疫保護的持續期。針對EBOV感染的免疫保護機制是復雜的，而且這一機制針對不同類型的疫苗也不一樣，大多數疫苗測試中，GP 糖蛋白特異性的體液免疫力不可或缺且足以保護受試者免受感染；細胞免疫對單針rAdv 載體疫苗免疫后產生的保護至關重要，而且CD8+T 細胞應答在VLP（GP-VP40）免疫后產生的保護中也是必需的。鑒于傳染病的暴發具有不可測性，對一線醫療救護人員單針普免絲狀病毒多價疫苗是應對此種突發公共衛生事件所必需的。多價絲狀病毒疫苗研究是未來EBOV 疫苗發展的方向。同時，為更好防止病毒進入人群，制備供野生動物使用的EBOV 疫苗對于保護人群健康也具有重要作用，這有待于對EBOV 儲存宿主的進一步確證，從而在傳播的早期階段或者針對中間宿主或終末宿主如猿類進行干預。◆