脂質氫過氧化物氧化對核桃分離蛋白結構的影響

王丹丹，孫領鴿，毛曉英

(石河子大學食品學院，新疆 石河子，832000)

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX)廣泛存在于動植物體內，它可以通過分子內加氧的方式催化多不飽和脂肪酸氧化產生脂質氫過氧化衍生物[1]，脂質氫過氧化衍生物能夠攻擊食品中的蛋白質組分，引起蛋白質發生氧化，降低食品品質[2-3]。蛋白質氧化使得蛋白主鏈發生斷裂、氨基酸殘基側鏈發生改變以及形成蛋白質交聯物[4]。目前研究發現，LOX催化多不飽和脂肪酸發生氧化，產生具有破壞活性的自由基，使得蛋白質之間相互作用，最終形成聚集體[5-6]；LOX誘導的脂質過氧化反應導致蛋白質的風味和某些功能性質發生不期望的變化[7-8]；HUANG的研究結果也表明，LOX催化亞油酸的產物能夠改變大豆蛋白的結構[9]。

核桃仁含有豐富的脂肪和蛋白質，桃仁油中不飽和脂肪酸含量很高，占總脂肪含量的 88.54%，其中不飽和脂肪酸中亞油酸含量為30.43%[10]。核桃中含有的不飽和脂肪酸極易氧化酸敗，從而誘導核桃蛋白發生氧化變質，最終影響核桃蛋白產品的色澤、風味及品質，降低核桃蛋白產品的商品價值[11]。核桃氧化酸敗根本原因是脂質發生自動氧化，產生過氧化物，從而氧化變質[12]。目前，LOX在核桃蛋白氧化酸敗中的作用及其調控機理還不清楚，因此本研究以脂肪氧合酶、亞油酸和核桃分離蛋白構建模擬氧化體系，研究脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對核桃分離蛋白結構特性的影響。

本研究以LOX催化亞油酸產生的脂質氫過氧化物(hydrogen peroxide lipid content, HPODE)對核桃分離蛋白進行不同程度的氧化，通過測定核桃蛋白樣品的溶解度、羰基含量、表面疏水性、圓二結構、內源熒光、相對分子質量分布等指標，研究脂質氫過氧化物所誘導的蛋白質氧化對蛋白質結構及理化特性的影響，探究核桃蛋白中脂質與蛋白質相互作用的機理，從而為核桃蛋白加工過程提高蛋白產品的質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆薄皮核桃：石河子市農貿市場；脂肪氧合酶(LOX I-B)(98 005 units/mg)：東京化成工業株式會社；亞油酸：色譜純；2,4-二硝基苯肼，1-苯氨基萘-8-磺酸等分析試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LGJ-18S 冷凍干燥機，北京松源華興科技有限公司；PHS-3C雷磁pH計，上海精科儀；臺式高速冷凍離心機，力康發展有限公司；HH-42快速恒溫數顯水箱，上海精宏試驗設備有限公司；F-7000熒光光譜儀，日本日立公司；MOS-450圓二色光譜儀，法國Biologic公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃分離蛋白的制備

參照毛曉英的方法[13]，以新產薄皮核桃為原料，堿液浸泡核桃仁，手動去皮、粉碎，正己烷脫脂后得到核桃蛋白脫脂粉。核桃蛋白脫脂粉用乙醇醇洗，將醇洗后的殘渣用去離子水溶解，經堿溶酸沉法制備核桃分離蛋白。收集沉淀，用去離子水調節沉淀pH 7.0，最后冷凍干燥得到核桃分離蛋白粉末(walnut protein isolate, WPI)，裝瓶置于4 ℃保存備用。

1.3.2 氧化核桃蛋白的制備

亞油酸溶液、酶液的制備以及模擬反應的建立參照葉林的方法[14]。

1.3.3 WPI溶解度的測定

取0.05 g核桃蛋白樣品溶于10 mL去離子水中，室溫下磁力攪拌2 h，5 000 r/min離心30 min，取上清液，釆用微量凱氏定氮法測定其蛋白含量。

(1)

式中：P為可溶蛋白的量；W為樣品蛋白的量。

1.3.4 WPI羰基含量的測定

參照HUANG等的方法[15]進行測定，采用2,4-二硝基苯肼在367 nm處進行比色。

1.3.5 WPI游離巰基含量的測定

參照HUANG的方法[15]，采用DNTB比色法。

1.3.6 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法。稱取0.05 g核桃蛋白樣品溶于10 mL 0.01 mol/L(pH 8.0)磷酸鹽緩沖液，采用BCA法測定離心后上清液中蛋白濃度。用0.01 mol/L(pH 8.0)磷酸鹽緩沖液稀釋核桃蛋白質量濃度在 0.005～0.5 mg/mL之間，加入50 μL 8 mmol/L ANS溶液，激發波長為395 nm，發射波長為473 nm。以蛋白質質量濃度為X軸，熒光強度值為Y軸，得到的斜率即為蛋白質表面疏水性指數。

1.3.7 WPI二級結構的測定

將0.05 g核桃分離蛋白分散于10 mL去離子水中，以雙縮脲法測定離心(8 000×g，30 min)后上清液中的蛋白質量濃度，并通過稀釋使得上清液中核桃蛋白質量濃度為 50 μg/mL。采用MOS-450 圓二色光譜儀測定190～250 nm之間的遠紫外CD光譜，最后以平均摩爾橢圓率[θ](deg cm2/dmol)表示。

1.3.8 WPI內源熒光測定

稱取0.05 g核桃蛋白樣品溶解于10 mL 0.01 mol/L (pH 8.0) 磷酸鹽緩沖溶液中，以雙縮脲法測定離心(8 000×g，30 min)后上清液的蛋白質量濃度，并通過稀釋使其質量濃度達到 0.1 mg/mL。采用熒光分光光度計以290 nm處為激發波長，掃描300～400 nm處的發散光譜，測定氧化WPI樣品的熒光光譜。其兩者的狹縫寬設置均為5 nm。

1.3.9 WPI相對分子量分布的測定

根據HUANG的方法[15]略改。將WPI樣品用去離子水配制為1 mg/mL的溶液，采用Water 2690型液相色譜系統檢測。

1.4 數據統計及分析

所有數據均測定3次，數據表示為平均值±標準差SD。采用SPSS 23.0對數據進行顯著性分析，使用Origin 8.5對數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 WPI溶解度的分析

蛋白質的溶解度是蛋白質與水之間相互作用的綜合結果，蛋白質的氨基酸組成，親/疏水性，所帶電荷等內部因素都會影響蛋白質的溶解度[16]。LOX催化亞油酸氧化對核桃蛋白溶解度的影響如表1所示。

表1 亞油酸不同添加量制備核桃蛋白溶解度、羰基、游離巰基和表面疏水性

注：樣品各指標為3次測定值的平均；數值表示為均值±標準誤差；同一列中的不同字母表示在P<0.05 水平上有顯著差異。

隨著亞油酸添加量的增加，核桃蛋白溶解度從8.94%下降到6.89%。但是亞油酸添加量≤4.5 mL時，核桃蛋白溶解度變化不顯著；亞油酸添加量≥7.5 mL，核桃蛋白溶解度顯著性下降(P<0.05)。核桃蛋白樣品溶解度下降是因為低濃度的氫過氧化物氧化使得核桃蛋白形成了可溶性聚集體，而高濃度的氫過氧化物氧化導致的共價交聯使得產生的可溶性聚集體進一步發生聚集形成不可溶性聚集體[17]。孫領鴿等[18]指出，丙烯醛氧化濃度逐漸增加，核桃蛋白溶解度顯著性下降。吳偉等[19]在研究過氧自由基氧化大米蛋白時發現，大米蛋白共價交聯形成不可溶性聚集體，使得大米蛋白溶解性降低。蛋白質與脂質氫過氧化物相結合之后，使得蛋白質的能態發生變化，引起蛋白質變性是導致蛋白質溶解度降低的內在原因。

2.2 WPI羰基含量的分析

蛋白質羰基含量是目前用于表征蛋白質氧化程度最為廣泛的指標。當亞油酸添加量為4.5 mL時，氧化核桃分離蛋白羰基從2.32 nmol/mg顯著增加到3.14 nmol/mg (P<0.05)，亞油酸添加量為9 mL時，蛋白質羰基值達到最高水平(4.23 nmol/mg)(表1)。ZIRLIN[20]研究了亞油酸甲酯對明膠的氧化，蛋白質和脂質反應產生的自由基作用，可以形成蛋白質自由基，蛋白質自由基容易被氧分子襲擊，導致蛋白質過氧化，而蛋白質羰基含量增加主要是由于α-碳原子或者側鏈氨基酸殘基的其他碳原子形成了蛋白質過氧化物。黃友如[21]在研究脂肪氧合酶催化亞油酸誘導大豆蛋白時發現，LOX -大豆分離蛋白、亞油酸-大豆分離蛋白氧化體系中，羰基含量無變化，LOX-亞油酸-大豆分離蛋白模擬體系中，羰基含量在反應1.0 h時明顯增加，這說明同時添加LOX和亞油酸致使大豆分離蛋白氧化。ZAMORA等[22]的研究發現，脂質氫過氧化物與蛋白質的氨基酸殘基反應后，導致蛋白質的羰基含量增加。以上結果顯示，脂質氫過氧化物氧化使核桃蛋白羰基含量增加，核桃蛋白的構象發生改變。

2.3 WPI巰基含量的分析

巰基氧化可以轉換形成二硫鍵，二硫鍵的形成引起蛋白質分子間發生交叉、聯結和聚合，進而導致蛋白空間結構發生變化[16,23]。不同添加量亞油酸對核桃分離蛋白游離巰基結果如表1所示，核桃分離蛋白游離巰基含量隨著亞油酸添加量的增加發生顯著下降，其分別從未氧化的巰基值2.82 μmol SH/g下降到1.92 μmol SH/g (P<0.05)。巰基含量的降低在一定程度上反映蛋白質的變性，可能是多肽形成分子間分子內二硫鍵，也可能是因為發生氧化形成其他氧化產物[21]。OBATA研究大豆豆漿時發現，大豆豆漿中巰基基團含量降低，可能與LOX氧化大豆蛋白密切相關[24]。GARDNER研究半胱氨酸和脂質過氧化氫反應時發現，HPODE可與蛋白質中半胱氨酸殘基形成穩定的加合物[25]，從而使得蛋白質中游離巰基含量下降。本實驗結果表明，較高的亞油酸添加量，核桃分離蛋白發生較充分的氧化作用，致使分子內部的游離巰基群含量下降。

2.4 WPI表面疏水性的分析

表面疏水性(H0)可以反映蛋白質分子與外界極性水環境相連的表面疏水性基團數量[26]，也可以用它來衡量蛋白質的變性程度，它能夠觀察出蛋白位點在化學上或物理上的微妙變化，所以可以作為評價蛋白變性的一個重要參數[16]。通常用ANS熒光探針法測量H0的變化，用于監測暴露在蛋白質表面的疏水位點，表征蛋白質的變性程度[27]。不同添加量亞油酸對核桃分離蛋白H0的影響如表1所示，亞油酸添加量從0 mL增加到9 mL時，核桃分離蛋白H0從429.66顯著下降到405.24 (P<0.05)，這意味著LOX催化亞油酸氧化體系誘使核桃蛋白表面呈現出親水性。H0下降的原因,一方面是由于氧化造成蛋白質分子去折疊，使得蛋白質內部的疏水集團外露，這些疏水基團再通過疏水作用形成了聚集體；另一方面，氧化形成的蛋白質共價交聯使得聚集反應進一步發展，從而形成抗蛋白酶水解的聚集體。H0下降表明氧化后的核桃蛋白構象發生改變。

2.5 WPI二級結構的分析

蛋白質中二硫鍵、芳香氨基酸殘基等具有光學性質，這些具有光活性的基團能夠產生偏振光[28]，在250 nm以下的遠紫外區的圓二色光譜(circular dichroism, CD)下，蛋白質溶液圓二色性的改變可以反映核桃蛋白二級結構的特征分布[29]。核桃蛋白樣品的CD圖譜見圖1和表2。

圖1 HPODE氧化核桃蛋白樣品的圓二CD圖譜

Fig.1 Circular dichroism spectra of walnut protein samples注：圖例中為亞油酸添加量，下同。

亞油酸添加量為0 mL時，WPI圓二色光譜圖在192 nm處有一個正峰，說明天然的核桃蛋白具有α-螺旋結構，200 nm處有一個較強的正譜帶，此處較接近β-轉角的譜帶，220～230 nm處出現微弱的正峰，此處可以表征蛋白質中存在無規則卷曲。在亞油酸添加量達到9 mL時，在192 nm處無正峰，200 nm處出現較強的負峰間，這一結果與吳偉等[30]研究蛋白質氧化對大米蛋白二級結構含量時的結果一致。說明脂質氫過氧化物氧化修飾使得核桃蛋白α-螺旋結構減少，無規則卷曲含量升高。葉林曾報道[31]，花生分離蛋白氫鍵和疏水性作用的改變是由于其二級結構變化而引起的，進而形成蛋白聚集體。

2.6 WPI內源熒光的分析

含有芳香族氨基酸殘基如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基的蛋白質在一定激發波長照射下會產生熒光，稱為內源熒光[32]。來源于紫外照射、衰老和暴露在過氧自由基氧化系統的二聚酪氨酸的結構可在320～360 nm的激發波長下展現熒光特性[33]。GIULIVI表明，暴露在脂質環境中的蛋白質，可以改變氨基酸的序列和蛋白質的組成結構，這些與熒光蛋白質交聯有關[34]。YE[35]研究花生蛋白氧化對結構影響時發現，花生蛋白熒光強度隨著氧化程度增加而下降且最大熒光峰位藍移，認為是氧化導致蛋白聚集體形成，色氨酸轉移到內部的非極性環境中。關于脂質氫過氧化物氧化核桃分離蛋白內源熒光的影響見圖2，結果表明，隨著亞油酸添加量的增加，核桃分離蛋白內源熒光強度逐漸下降，從1 009下降到840，而當亞油酸添加量為0～7.5 mL時，其最大熒光峰紅移，從330 nm移動到335 nm。熒光峰位紅移可以說明熒光發射基團暴露于極性環境下，如溶劑(水)[36]，這與蛋白質表面疏水性下降結果一致。上述結果說明，LOX催化亞油酸產生的氫過氧化物氧化能使色氨酸的微環境變得親水。進而可以得出，氧化可以導致核桃蛋白的構象發生變化。

圖2 HPODE氧化核桃分離蛋白內源熒光的影響

Fig.2 Effect of oxidation modification by HPODE on the intrinsic fluorescence of walnut protein

2.7 WPI相對分子量分布的分析

脂質氫過氧化物氧化對核桃分離蛋白分子量分布的影響如表2所示，核桃蛋白分子量分布圖中大部分都出現4個峰，保留時間依次為 5.87、12.3、 13.0和14.4 min，其中保留時間 5.87 min峰對應蛋白質聚集體，保留時間 12.3 min和13.0 min峰對應核桃蛋白和亞基，保留時間 14.4 min峰對應核桃蛋白中天然存在的小肽。隨著亞油酸添加量的增加，氧化程度逐漸加大，核桃蛋白保留時間5.87 min峰面積比例持續增加，表明核桃蛋白氧化形成聚集體。當亞油酸添加量增加時，其相對分子質量逐漸變大。根據保留時間和相對分子質量對應標準曲線(y=-1.443x+25.74)得出，亞油酸添加量達到9 mL，其相對分子質量為6.9 kDa(38.65%)、8.1 kDa(32.54%)，而4.96 kDa的小分子多肽幾乎檢測不到。從結果可以看出，亞油酸添加量增大，氫過氧化物氧化程度增加，誘導WPI形成小的聚集體，聚集體進一步聚集，形成較大的顆粒聚集體。黃友如在研究LOX催化亞油酸氧化對大豆蛋白影響時也證實，LOX催化亞油酸氧化反應時間越長，大豆蛋白的聚集程度越大[21]。此結論與上文闡述的二級結構變化相吻合。

表2 脂質氫過氧化物氧化核桃分離蛋白分子量分布

3 結論

本實驗以核桃分離蛋白為研究對象，建立LOX-亞油酸-核桃分離蛋白氧化模型，研究脂質氫過氧化物氧化對核桃分離蛋白結構的影響，研究結果表明：(1)脂質氫過氧化物氧化可以促進蛋白質氧化反應的發生，蛋白質的氧化程度隨著亞油酸添加量的增加而增加；(2)隨著核桃蛋白氧化程度的增加，蛋白質的表面疏水性和內源熒光都發生顯著的變化，蛋白質表面疏水性逐漸減小，最大熒光峰位紅移且熒光強度下降；(3)脂質氫過氧化物氧化使核桃蛋白的二級結構發生變化，有序的α-螺旋和β-折疊含量下降的同時無序的β-轉角和無規卷曲含量增加，蛋白質穩定的二級結構遭到破壞；(4)脂質氫過氧化物氧化，致使蛋白質小分子多肽含量減少，轉化成氧化聚集體。本研究結果表明，脂質氫過氧化物氧化對核桃分離蛋白的結構產生了一定的影響，由于蛋白質的結構決定其功能性，因此，氧化對蛋白結構產生的影響會進一步影響蛋白的功能。在核桃蛋白的加工及貯藏過程中了解其發生蛋白質氧化的程度，對提高核桃蛋白產品的品質和應用具有重要的理論和實踐意義。