蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體制備及性質

田倚凡，陳芳，譚小路，趙國華，葉發銀*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶，400715) 3(重慶工商大學 環境與資源學院，重慶,400067)

蘿卜硫素(1-異硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷)又稱“萊菔硫烷”，是存在于西蘭花、白蘿卜、芥藍、甘藍等十字花科蔬菜中的生物活性物質[1]，因具有良好的抗氧化[2]、抗菌[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]等生理活性，受到國內外學者及功能性食品行業的廣泛關注。天然的蘿卜硫素一般從西蘭花或甘藍的種子中提取，常溫下為無色或淡黃色油狀液體。在烹調過程中，蔬菜中的蘿卜硫素會因降解受到損失，提取純化的蘿卜硫素在受熱[6]或遇堿[7]時更容易降解，蘿卜硫素的不穩定性使其在膳食補充劑和功能性食品中的應用受到限制。因此如何提升其穩定性及生物利用度成為研究的重點任務之一。研究表明，蘿卜硫素可與羥丙基-β-環糊精形成包合物，包合作用使得蘿卜硫素對熱、氧化劑、堿等環境因子的抗性明顯增強[8]，包合后蘿卜硫素的降解活化能可提高3.4～7.7 kJ/mol[9]。WANG等[10]研究了羧甲基殼聚糖-海藻酸微球材料包埋蘿卜硫素，結果表明，游離態蘿卜硫素210 min內(pH7.4)完全降解，而微球包埋使其在相同條件下的降解率減小到10%以下。TIAN等[11]研究發現羥丙基-β-環糊精、麥芽糊精和大豆分離蛋白分別作為壁材，通過噴霧干燥制備蘿卜硫素微膠囊，均能有效提高其穩定性。郭春靜等[12]研究了脂質體對姜黃素和蘿卜硫素的共包埋技術。DANAFAR等[13]制備了荷載蘿卜硫素的MPEG-PCL共聚物納米顆粒，并考察了納米顆粒向乳腺癌細胞遞送蘿卜硫素的性能。以上結果為蘿卜硫素的包埋及穩定化提供了重要參考。

近年來，利用玉米醇溶蛋白構建生物活性物質負載體系的研究備受重視[14-15]。玉米醇溶蛋白不溶于水和低鹽水溶液，但可溶于低級醇的水溶液，在70%乙醇水溶液具有較好的溶解性。利用這一特性，可將溶解了生物活性物質和玉米醇溶蛋白的乙醇水溶液中滴加到水相中均質，二者共沉淀形成納米或亞微米顆粒[15-16]。LI等[17]通過反溶劑法制備了負載百里香酚的玉米醇溶蛋白納米顆粒，通過緩釋百里香酚能較好地抑制新鮮M-H肉湯中金黃色葡萄球菌的生長。DA ROSA等[18]研究指出構建的負載抗菌劑百里香酚和香芹酚的玉米醇溶蛋白納米顆粒具有良好的貯藏穩定性，對抗菌劑的釋放均勻持久(72 h內50%釋放量)。利用玉米醇溶蛋白的荷載特性，本研究采用反溶劑法制備蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體，制備時在水相中添加低濃度的阿拉伯膠為穩定劑，研究其對蘿卜硫素的荷載及釋放特性，以期為蘿卜硫素負載體系構建提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白(產品編號Z3625)，阿拉伯膠(產品編號G9752)，dl-蘿卜硫素(產品編號S4441)購自上海Sigma試劑有限公司；dl-蘿卜硫素(生化試劑級)，購自百靈威科技有限公司；二氯甲烷、乙腈，色譜純，購于上海邁瑞爾化學技術有限公司；其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-26型數顯恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；85-2A型數顯恒溫磁力攪拌器，江蘇科析儀器有限公司；pHS-25CW型pH計，上海般特儀器制造有限公司；SHB-III型循環水式多用真空泵及RE-5298型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；UV-2600型分光光度計，日本島津公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；JEM-1400透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體制備

采取反溶劑法制備蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體[17]。首先配制有機相。配制體積分數80%的乙醇水溶液，將一定比例的蘿卜硫素和玉米醇溶蛋白溶解，二者質量之比m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)為0∶25、1∶25、2∶25、3∶25、4∶25及5∶25，玉米醇溶蛋白質量濃度固定為15 g/L。接著配制水相。稱取1 000 mg阿拉伯膠，加熱攪拌溶解，0.45 μm濾膜過濾后，定容為500 mL水溶液(去離子水稀釋)，阿拉伯膠含量為2.0 g/L。有機相與水相混合方式：1倍體積的有機相采用恒壓滴液漏斗緩緩滴加到5倍體積水相中，滴加速度約0.1 mL/min，水相中放置電磁攪拌。得到的水分散體采取減壓蒸餾去除乙醇，3 000 r/min低速離心10 min去除其中的大顆粒，得到蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體。

1.3.2 納米顆粒的基本性質

納米顆粒形貌采用透射電子顯微鏡分析[18]，稀釋后的納米水分散體滴加到微柵支持膜載網上，在空氣中干燥，質量分數2%的醋酸鈾染色30 s，多余的染劑采用濾紙吸走，之后在JEOL JEM-1400電鏡上觀測，加速電壓100 kV。納米顆粒的粒徑及分布、ζ-電位采用Malvern Nano-ZS測定[17]。

1.3.3 蘿卜硫素的包封率及載量計算

將一定體積納米水分散體于高速冷凍離心機,于14 000 r/min離心55 min，得到上清液，用二氯甲烷萃取其中的蘿卜硫素，高效液相色譜法測定其含量(m0)；將得到的沉淀進行真空冷凍干燥，得到一定量(m1)的凍干粉，采用相同體積的二氯甲烷萃取其中的蘿卜硫素，高效液相色譜法分析其含量(m2)；納米顆粒對蘿卜硫素的包封率(EE)定義為：納米顆粒中蘿卜硫素的質量與樣品中加入蘿卜硫素的總質量(mt)之比：

(1)

對蘿卜硫素的載量(LC)定義為:單位質量(g)納米顆粒中蘿卜硫素的質量(g)：

(2)

1.3.4 蘿卜硫素定量分析方法

首先，制作蘿卜硫素的紫外掃描圖譜。將蘿卜硫素用二氯甲烷稀釋成適當濃度，放置在石英比色皿中，在UV-2600(島津公司)上獲取210～400 nm的紫外掃描圖譜，結果如圖1-A所示。蘿卜硫素在242 nm處有較強的紫外吸收峰。采用二氯甲烷將蘿卜硫素稀釋成不同質量濃度：0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/L，在Agilent 1200型高效液相色譜儀上進行定量分析，色譜柱Eclipse XDB C18(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)，流動相為30%乙腈+70%水(體積分數)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長242 nm。

圖1 蘿卜硫素的紫外掃描圖譜(A)、分子結構式(B)及高效液相色譜圖(C)

Fig.1 The UV profile (A), structure formula (B) and HPLC chart(C) of sulforaphane

根據其標準品出峰(tR=5.5 min)的峰面積(圖1-C)制作工作曲線(圖2)，得到擬合方程：y=2 617.7x+3.1(R2=0.995)，線性范圍0.02～1.0 mg/L。

圖2 蘿卜硫素標準曲線

Fig.2 Calibration of sulforaphane standard

1.3.5 蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體的穩定性

考察納米水分散體在不同pH值和環境溫度的平均粒徑變化情況。考察pH時，采用1 mol/L的HCl或NaOH調節新制備的納米水分散體的pH為2、3、4、5、6、7及8，室溫靜置存放過夜；考察環境溫度時，新制備的納米水分散體在不同水浴溫度下(25、35、45、55、65、75及85 ℃)保溫電磁攪拌30 min，然后室溫靜置存放過夜。測定處理前后納米水分散體的粒徑變化。

1.3.6 蘿卜硫素從納米水分散體的釋放分析

依次在模擬胃液(0～120 min)和模擬小腸液(120～240 min)中考察蘿卜硫素的釋放情況。取在37 ℃保溫30 min的2 mL新制備納米水分散體與18 mL模擬胃液(含0.05 mol/L HCl和2.5 g/L胃蛋白酶)混合，37 ℃水浴保溫，100 r/min攪拌，定時(0，60，90，120 min)取樣，采用超濾離心管(MWCO 100 kDa)處理得到透過液，經二氯甲烷萃取后測定蘿卜硫素含量。120 min后，向其中加入模擬小腸液(含2.5 g/L胰酶、30 g/L膽鹽，用于0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液配制)，37℃水浴保溫，100 r/min攪拌，定時(0，60，90，120 min)取樣，測定蘿卜硫素含量。

1.3.7 數據處理與統計分析

除電鏡分析外，所有試驗重復測定3次，結果以平均值±標準偏差表示；采用SPSS 18.0對試驗數據進行單因素方差分析，通過Duncan’s多重比較，顯著性水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體基本性質

由圖3-A可知，玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠顆粒平均粒徑為184 nm，多分散性指數(PDI)0.134，在文獻研究報道范圍內[15]。負載蘿卜硫素后，顆粒平均粒徑相對減小(159.8～180.2 nm)，當m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)為4∶25時為平均粒徑的最小值(P<0.05)；PDI則在負載蘿卜硫素后增大(0.152～0.198)，且在m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)為1∶25時出現最大值(p<0.05)。玉米醇溶蛋白顆粒在負載后的粒度一般會發生變化。研究顯示，經pluronic F68穩定的玉米醇溶蛋白顆粒在負載百里香酚和香芹酚后平均粒徑從153.9 nm分別減小到109.2 nm及111.2 nm[18]；經茶多糖穩定的玉米醇溶蛋白顆粒在負載紫杉醇后平均粒徑和多分散指數均減小，且減小程度與制備時紫杉醇的添加量正相關[19]；而對于賴氨酸穩定的玉米醇溶蛋白顆粒在負載葉酸后，平均粒徑從164 nm增加到193 nm，多分散指數從0.07增加到0.20。由圖3-B可知，負載蘿卜硫素對玉米醇溶蛋白顆粒納米水分散體的ζ-電位影響不大，在-35 mV左右，表明納米水分散體具有較好的穩定分散特性[20-21]。

圖3 蘿卜硫素與玉米醇溶蛋白質量比對納米水分散體的粒徑、粒徑分布(A)及zeta電位(B)的影響

Fig.3 The effect of sulforaphane to zein weight ratio on the average particle size, PDI (A), and zeta potential (B) of sulforaphane-encapsulated zein aqueous nano-dispersions注:不同字母上標(a～b) 表示不同樣品P<0.05 水平的差異顯著性。

由圖4可知，玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠顆粒及負載蘿卜硫素的顆粒近球形，通過電鏡自帶軟件計算其尺寸為納米級。需要指出，通過透射電鏡測得顆粒的直徑顯著小于通過馬爾文Nano-ZS納米粒度儀測定結果，原因在于二者測量方式存在差異。透射電鏡測定干燥樣品，顆粒干燥時發生脫水收縮，因此測定尺寸較小；Nano-ZS直接對水分散體進行測定，測得的是水相中顆粒的水力學直徑，因此尺寸較大。圖中顯示部分顆粒之間存在粘連現象，這一方面可能與反溶劑法制備特點有關，有機相滴加到水相時經剪切形成細小液滴，有機相中的乙醇向水相擴散溶解導致液滴收縮“硬化”，未完全“硬化”前，一部分顆粒通過擴散或布朗運動粘連在一起，大部分顆粒通過靜電作用向表面沉積阿拉伯膠使得穩定分散[16]；另一方面可能與電鏡制樣過程有關[18]。課題前期研究發現，使用碳支持膜載網觀測時，由于碳支持膜為疏水表面，玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠顆粒成團聚集，經輝光放電處理碳支持膜，對負載于上樣品分散性提升不明顯，后改用微柵支持膜載網得到圖4結果。

m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)分別為：A-0∶25;B-1∶25;C-3∶25;D-5∶25

圖4 蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體的透射電鏡照片

Fig.4 TEM images of sulforaphane-encapsulated zein aqueous nano-dispersions

2.2 玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒對蘿卜硫素的包埋特性

由表1可知，當m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)為1∶25時，其包封率為92.3%，載量43.4 mg/g；隨著m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)的增加，玉米醇溶蛋白對蘿卜硫素包封率顯著降低(P<0.05)，當m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)為4∶25時，其包封率與以麥芽糊精為壁材經噴霧干燥得到的微膠囊的包封率相當[22]。表1顯示，載量隨著m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)的增加幅度不大，其大小約60.6～78.7 mg/g，與葉酸-玉米醇溶蛋白納米顆粒體系的載量相當[23]。根據對文獻的調研發現，荷載物質的性質是影響玉米醇溶蛋白對荷載物質載量的重要因素。研究顯示，玉米醇溶蛋白對疏水性物質(如α-生育酚[24]、姜黃素[25])具有較高的載量，而對于弱極性物質的荷載能力有所下降。研究表明，經酪蛋白酸鈉穩定的玉米醇溶蛋白納米顆粒對阿霉素的包封率為90.06%時載量為15.01 mg/g[21]。

表1 不同m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)質量比下的蘿卜硫素包封率及載量

注:同一列不同字母上標(a～e)表示不同樣品P<0.05水平的差異顯著性。

2.3 環境條件對蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體的影響

水相pH主要影響著玉米醇溶蛋白的電荷頻率以及顆粒表面包被的阿拉伯膠帶電基團的解離程度。玉米醇溶蛋白等電點為6.8左右[26]，在酸性條件下帶正電荷，通過靜電相互作用與被膜的阿拉伯膠復合在一起。阿拉伯膠為陰離子型阿拉伯半乳聚糖-蛋白質復合物[27]，其分子結構中的糖醛酸基pKa值為1.88[28]或2.2[29]，在pH 2～8范圍內主要帶負電荷。由圖5-A可知，隨著pH升高，pH 2～4時顆粒平均粒徑顯著減小(P<0.05)，表明顆粒逐漸“緊縮”了水力學尺寸，水合能力降低，這與玉米醇溶蛋白顆粒表面的電荷頻率降低有關。pH 4～8時形成的納米顆粒的平均粒徑都較小且變化不顯著(P>0.05)。本研究結果與關于阿拉伯膠-玉米醇溶蛋白復合納米顆粒包埋薄荷油的研究一致，即低pH(3.0)時顆粒的平均粒徑最大，之后平均粒徑隨pH的增加而減小[30]。

在食品的加工儲藏過程中，溫度的變化對產品的貨架期有重要的影響，因此有必要研究溫度對蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體穩定性的影響。由圖5-B可知，隨著環境溫度升高，25～55 ℃時，顆粒平均粒徑變化不顯著(P<0.05)，蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體相對穩定；55～85 ℃時，蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米顆粒的平均粒徑從200 nm左右增加到350 nm左右，表明較高溫度條件下納米顆粒發生了“溶脹”，原因可能是玉米醇溶蛋白與阿拉伯膠的結合力減弱，顆粒水合能力增加，導致顆粒水力學尺寸變大。CHEN等[30]的研究顯示水相pH 5～8范圍內的玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒經高溫熱處理(80 ℃，30 min)粒徑(d4,3)未發生顯著變化。這表明玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒的熱穩定性相對較好。在對負載橘皮素的玉米醇溶蛋白-β-乳球蛋白復合納米顆粒的熱穩定性研究中，結果顯示低溫熱處理(25～55 ℃)對顆粒粒度影響不顯著，但高溫熱處理(60～90 ℃)導致粒度急劇增加，研究認為β-乳球蛋白熱變性導致相互作用力的改變是主要原因[31]。

圖5 水相pH值(A)及溫度(B)對納米水分散體平均粒徑的影響

Fig.5 Effect of pH (A) and temperature (B) on the average size of sulforaphane-encapsulated zein aqueous nano-dispersions

2.4 模擬消化液中蘿卜硫素的釋放

由圖6可知，在模擬胃液中，0～60 min內，m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)為1∶25的納米水分散體中蘿卜硫素的累計釋放率將近50%，快于m(蘿卜硫素)∶m(玉米醇溶蛋白)為2∶25的納米水分散體，后者約40%，這可能與前一組樣品的多分散性(圖2-A)有關；之后兩者差距逐漸縮小，90 min后的累計釋放率無顯著差異。0～120 min內，兩組樣品的累計釋放率將近80%，為快速釋放型；120～240 min，在模擬小腸液中，納米水分散體中蘿卜硫素的累計釋放率將近95%。采用MPEG -PCL共聚物納米顆粒包埋蘿卜硫素，其在pH 5.5的釋放速率顯著高于pH7.4，原因在于pH變化導致共聚物納米顆粒結構變化，影響了蘿卜硫素的結合能力，從而改變了釋放速率[13]。采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球包埋的蘿卜硫素20 d的累計釋放率約5%，具有良好的緩釋性能[32]。活性成分從載體中的釋放與活性成分與載體結合程度、活性成分在溶劑中的溶解性、載體的穩定性、溫度等多種因素有關。在不添加消化酶的磷酸鹽緩沖液(PBS)體系中，負載在由卵磷脂和pluronic F127穩定的玉米醇溶蛋白納米顆粒中的葉黃素，在PBS中(pH 7.4，37℃)放置168 h的累計釋放率為40%[33]；牛至油在玉米醇溶蛋白納米顆粒中的累計釋放率(PBS，pH 7.4，37℃，48 h)為60%左右[34]；在模擬消化液中，玉米醇溶蛋白納米顆粒包埋的表沒食子兒茶素沒食子酸酯釋放速度較快[35]。研究表明，玉米醇溶蛋白納米顆粒對消化酶具有一定抗性[15]，并且阿拉伯膠對消化酶不敏感[36]，因此結合圖5的數據來看，蘿卜硫素的快速釋放(圖6)主要可能與蘿卜硫素在玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒中的分布狀態有關。蘿卜硫素分子(圖3-B)的亞硫酰基賦予其相當的極性(logP=0.23)[37]，導致蘿卜硫素不太可能聚集在顆粒內核而是分布在外層，由此造成蘿卜硫素的快速釋放。

圖6 模擬消化液中蘿卜硫素的釋放情況

Fig.6 The release of sulforaphane from aqueous nano-dispersion upon stimulated gastric/ intestinal fluid注：0～120 min內在模擬胃液中，120～240 min內在模擬小腸液中

3 結論

本文采用反溶劑法制備蘿卜硫素-玉米醇溶蛋白納米水分散體。結果表明：包埋蘿卜硫素的玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠納米顆粒近球形，粒徑159.8～180.2 nm，多分散指數0.152～0.198，ζ-電位-32.1～-37.5 mV；當蘿卜硫素與玉米醇溶蛋白的質量比為1∶25，包封率為92.3 %，載量43.4 mg/g；隨著二者質量比的增加，包封率顯著下降，載量增加幅度不大，約60.6～78.7 mg/g。隨著pH升高，pH 2～4時顆粒平均粒徑顯著減小，pH 4～8時其變化不顯著；隨著環境溫度升高，25～55 ℃時，顆粒平均粒徑變化不顯著，55～85 ℃，平均粒徑從200 nm左右增加到350 nm左右。釋放實驗結果表明，玉米醇溶蛋白納米顆粒中的蘿卜硫素為快速釋放型。