CD68和VEGF在膀胱癌組織及50例正常膀胱組織中的表達

張新明，郭德迎，何海填，葉宗岳，曹石金，徐 冉

(1. 深圳市蛇口人民醫院泌尿外科，廣東 深圳 518067；2. 中南大學湘雅二醫院泌尿外科，湖南 長沙 410011)

膀胱癌是我國泌尿系統最常見的腫瘤之一，是一種直接威脅患者生存的疾病[1]。膀胱癌手術后容易復發、轉移，為臨床治療帶來難題。肌層浸潤性膀胱癌在行根治性膀胱切除后，50%以上的病人會發生轉移，5年生存率36%～54%，其發生發展及轉移的具體機制亟待進一步研究[2-4]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages， TAMs)也稱腫瘤組織局部浸潤巨噬細胞，在腫瘤組織微環境中發揮著免疫抑制效應，促進瘤內血管新生、腫瘤增殖、侵犯及轉移[5-8]，目前已經有大量TAMs與腫瘤關系方面的研究，但TAMs在人膀胱癌組織中的表達在國內外尚罕見報道。CD68是一種分子量為110 kDa的糖蛋白，此抗體可作為研究人體多種組織巨噬細胞的標志物；而血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)是一種選擇性的內皮細胞有絲分裂原，特異性地作用于血管內皮細胞，促進其增殖，在原位組織誘導血管生長，是腫瘤血管形成過程中的關鍵因子。本研究以CD68標志腫瘤相關巨噬細胞，擬通過研究CD68及VEGF在膀胱癌組織中及正常膀胱組織中的表達情況，來觀察TAMs及VEGF對膀胱癌的影響，從而為膀胱癌的治療和預后判斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 于深圳市蛇口人民醫院和中南大學湘雅二院共收集2015年1月至2016年12月因膀胱腫瘤行手術治療的50例患者切除的膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織(距腫瘤邊緣5 cm以外)的標本。患者年齡40～70歲，其中男性32例，女性18例，術后病理回報均為高級別浸潤性尿路上皮癌。所有患者術前均未接受任何放療化療，組織標本在液氮中常規保存。按照倫理委員會的相關要求，所有患者均術前簽署手術標本用于科研的同意書。

1.2 CD68和VEGF的表達測定 采用免疫組化法測定組織中CD68和VEGF的表達。膀胱癌組織及正常膀胱組織進行常規石蠟切片制作，二甲苯脫蠟后進行復水，30 g/L H2O2室溫孵育5～10 min消除過氧化物酶(內源性)的活性，采用熱修復法進行抗原修復，滴加50 g/L BSA 進行常規封閉30～45 min。分別加入1∶50 稀釋的兔抗人一抗(CD68或VEGF)，4 ℃冰箱內放置12～18 h。PBS 沖洗后加入聚合 HRP 標記抗兔 IgG，常溫避光放置30～45 min，PBS 沖洗，用DAB顯色試劑盒顯色，再進行常規蘇木素染色、脫水透明后封片，采用Image-pro plus 6.0計算平均光密度定量分析TAMs以及VEGF的表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件對實驗數據進行分析，計量資料的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

免疫組化結果顯示，CD68在正常膀胱組織中表達呈陰性，而在膀胱癌組織中CD68陽性TAMs的數量明顯增加，膀胱癌組織的平均光密度值顯著高于正常膀胱組織 (P<0.01)(表1，圖1)；膀胱癌組織中VEGF的平均光密度值顯著高于正常膀胱組織 (P<0.01)(表1，圖2)。未發現年齡、性別差異對膀胱癌組織中的CD68和VEGF的表達的影響。

表1 兩組膀胱組織中CD68和VEGF表達平均光密度值

圖1 CD68在不同膀胱組織中的表達(免疫組化法×400)

圖2 VEGF在不同膀胱組織中的表達(免疫組化法×400)

3 討 論

近年來我國膀胱癌發病率呈明顯的上升趨勢，流行病學研究表明，50%～70%非肌層浸潤性膀胱癌在5年內復發，而復發腫瘤中約30%表現為更高級別和浸潤性[9-10]。膀胱癌的病因不明，常規病理組織學在膀胱癌診斷方面受到限制[11]。因此研究導致膀胱癌發生發展的相關分子生物學標志物具有重要的意義。最新研究表明，TAMs在實性腫瘤中起著促進腫瘤生長、侵襲及轉移的作用[12-14]。

TAMs是指位于腫瘤組織中的M2型巨噬細胞，腫瘤組織間質的大部分由TAMs構成，通過腫瘤微環境影響腫瘤生物學行為和治療效果。研究表明TAMs可分泌大量的促進血管生成的細胞因子以及一系列調節血管生成的基質金屬蛋白酶類，從而促進腫瘤血管生成[15-17]。除了細胞因子和生長因子，TAMs還可以通過表達一些其他介質誘導血管生成促進侵襲轉移，如環氧合酶和波形蛋白等[18]。本研究通過免疫組化實驗檢測了不同膀胱組織中TAMs標志物CD68的表達，結果表明CD68在正常膀胱組織中表達呈陰性，而在膀胱癌組織中CD68陽性TAMs的數量明顯。

VEGF是一種細胞有絲分裂原，能誘導血管內皮細胞增殖，并誘導血管生長，是參與血管形成的最重要因子。已有大量研究結果表明，VEGF在腫瘤的發生發展過程中起重要作用。國內外研究顯示，腫瘤生長及轉移依賴于血管形成[19]。本研究通過免疫組化檢測了不同膀胱組織中VEGF蛋白表達水平，結果表明膀胱癌組織中VEGF較正常膀胱組織明顯高表達，與國內外研究結果一致。

本研究初步觀察到CD68及VEGF在膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達存在差異，提示在膀胱癌組織中TAMs及VEGF明顯活躍，故可以推測在膀胱癌組織中也存在類似其他實體腫瘤組織中的TAMs對腫瘤細胞的生長的促進作用。同時有理由相信TAMs對VEGF的形成也可能有促進作用，它通過直接或間接刺激VEGF的形成，誘導血管內皮細胞增殖、活化、遷移，形成新的毛細血管，為腫瘤生長提供營養支持，進而促進了膀胱癌細胞的發生、發展、侵襲和轉移。這為下一步深入研究TAMs是如何刺激VEGF的分泌，以及如何阻斷TAMs對VEGF的促進作用提供了實驗基礎，從而可能對膀胱癌的預防及治療產生深遠的影響。總之，TAMs及VEGF在膀胱癌的發生及發展中的相互關系值得進一步研究。