枸杞多糖對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞輻射損傷后的保護(hù)作用研究

關(guān)素珍，德小明，龐克華，楊惠芳*

（寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，寧夏 銀川 750001）

電離輻射廣泛存在于自然界，一定劑量的射線可以對(duì)人體造成傷害。因射線看不到、摸不著，經(jīng)常被忽視，只有給人們帶來巨大損害時(shí)才意識(shí)到。因此，尋找一些對(duì)輻射損傷具有保護(hù)作用的藥物非常重要。研究表明，中藥類多糖對(duì)于機(jī)體受到輻射損傷能起到較好的恢復(fù)作用[1]，而枸杞多糖（lyceum barbarum polysaccharide，LBP）是從中草藥枸杞中提取出來的一種高含糖類成分[2]，其對(duì)輻射所導(dǎo)致的損傷是否具有保護(hù)作用值得探究。因此，本實(shí)驗(yàn)建立體外X射線照射脊髓神經(jīng)（spinal cord nerve，SCN）細(xì)胞的損傷模型，研究LBP干預(yù)對(duì)輻射損傷模型的保護(hù)作用并檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)的情況，為L(zhǎng)BP抗輻射損傷的機(jī)制研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 脊髓神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)移

大鼠SCN細(xì)胞原代培養(yǎng)于培養(yǎng)基內(nèi)（DMEM+9%的胎牛血清+1%的青霉素-鏈霉素配置的細(xì)胞培養(yǎng)液），置CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基，進(jìn)行復(fù)蘇、傳代及凍存后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，加入0.5 mL的0.25%胰蛋白酶，在顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞懸浮起來時(shí)加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液后，用移液管吹打，然后將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)入離心管中，以800 r/min離心5 min，去除上清，加2 mL PBS將細(xì)胞清洗1遍，1 000 r/min再次離心3 min，去除上清加入新的培養(yǎng)基，將細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞貼壁后用于制備SCN細(xì)胞輻射損傷模型。

1.2 SCN細(xì)胞輻射損傷模型的建立

采用直線加速器，分別用低（2 Gy）、中（6 Gy）、高（10 Gy）劑量的X射線輻射干預(yù)SCN細(xì)胞，劑量率為500 cGy/min，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組（不經(jīng)X射線輻射），各組細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.3 MTT法檢測(cè)X射線輻射對(duì)SCN細(xì)胞活性的影響

培育24 h后，每孔加入四甲基噻唑藍(lán)（tetramethylthiazole blue，MTT）20 μL 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，使MTT被還原為甲臜。吸出每孔中的液體，加入150 μL DMSO使甲臜消融。再置搖床上緩慢搖勻10～15 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的光密度D（550）值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。

細(xì)胞存活率=[D（550）實(shí)驗(yàn)組-D（550）空白組]/[D（550）對(duì)照組-D（550）空白組]

1.4 MTT篩選最適的LBP濃度

篩選實(shí)驗(yàn)分為5組即空白組（細(xì)胞培養(yǎng)液），輻射組（10 Gy X射線照射），輻射+LBP組（共3個(gè)劑量，X射線照射后，分別調(diào)整LBP濃度至10、25、40 mg/L），各組培養(yǎng)24 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，方法同1.3。

1.5 LBP對(duì)輻射損傷SCN細(xì)胞模型自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

采用免疫組化及Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)，用IPP 6.0軟件測(cè)定免疫組織化學(xué)的光密度值，用Image J分析測(cè)定Western blot條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較選用LSD-t檢測(cè)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)不同輻射劑量X射線對(duì)脊髓神經(jīng)元的影響

2、6、10 Gy X射線照射后SCN細(xì)胞的存活率分別為（85.00±3.91）%、（70.00±1.63）%和（49.25±7.59）%，和正常對(duì)照組[（100.00±3.46）%]比較明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。可見X射線能明顯降低SCN細(xì)胞的活性，且隨著射線劑量的增高，SCN細(xì)胞活性降低，10 Gy照射后SCN細(xì)胞活性較2和6 Gy組明顯降低（P＜0.05），故本課題后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇劑量為10 Gy建立脊髓神經(jīng)細(xì)胞輻射損傷模型。見圖1。

圖1 不同輻射劑量X射線對(duì)脊髓神經(jīng)元的影響

2.2 LBP對(duì)輻射誘導(dǎo)SCN細(xì)胞存活率的影響

輻射組的細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。10、25、40 mg/L濃度的LBP干預(yù)后，細(xì)胞的存活率分別為（57.25±3.09）%、（60.25±5.56）%、（70.25±2.87）%，與輻射組[（49.25±7.59）%]相比明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。LBP 40 mg/L組細(xì)胞活性最高，且與10和25 mg/L比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），所以選擇40 mg/L的LBP作為藥物干預(yù)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

圖2 LBP對(duì)輻射誘導(dǎo)SCN細(xì)胞存活率的影響

2.3 LBP對(duì)輻射損傷SCN細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3 II/I表達(dá)的影響

免疫組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果見圖3、圖4和表1，均顯示與正常對(duì)照組相比，輻射組細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3 II/I表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與輻射組相比，LBP+輻射組細(xì)胞LC3 II/I蛋白表達(dá)亦明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

電離輻射作用于組織時(shí)可引起光電效應(yīng)、康普頓效應(yīng)和電子對(duì)效應(yīng)等[3]。因細(xì)胞中含有的重要成分為水分和蛋白質(zhì)，當(dāng)射線照射細(xì)胞可引起蛋白質(zhì)變性，發(fā)生電離，主要是去氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)斷裂，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，引起自身死亡和突變等。動(dòng)物脊髓神經(jīng)細(xì)胞因其是永久細(xì)胞，細(xì)胞特殊的穩(wěn)定性為實(shí)驗(yàn)提供了保障[4]。已有研究表明，SCN細(xì)胞當(dāng)受到外界刺激時(shí)，比其他細(xì)胞更容易發(fā)生自噬[5]，因此本實(shí)驗(yàn)選用SCN細(xì)胞株作為研究對(duì)象。

圖3 免疫組化檢測(cè)輻射損傷SCN細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 II/I的表達(dá)

圖4 Western blot檢測(cè)SCN細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 II/I的表達(dá)

表1 LBP對(duì)輻射損傷SCN細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 II/I表達(dá)的影響s）

表1 LBP對(duì)輻射損傷SCN細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 II/I表達(dá)的影響s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與輻射組比較，#P＜0.05.

Western blot條帶灰度值1.02±0.12 1.71±0.16*2.16±0.22*，#組別對(duì)照組10 Gy X射線輻射組10 Gy X射線輻射+40 mg/L LBP組免疫組化光密度值1.48±0.48 7.20±0.76*13.50±2.36*，#

射線廣泛存在我們周圍，醫(yī)院內(nèi)直線加速器產(chǎn)生的X射線劑量容易控制，且操作簡(jiǎn)單，因此選用此方式照射SCN細(xì)胞建立輻射損傷模型，具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，近些年被普遍應(yīng)用于建立輻射損傷模型。本實(shí)驗(yàn)用（2、6、10 Gy）3個(gè)劑量梯度的X射線損傷SCN細(xì)胞，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀測(cè)到隨X射線劑量的不斷增加，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞變圓、變小。10 Gy劑量X射線照射所造成SCN細(xì)胞存活率明顯降低，約為正常對(duì)照組的50%，所以本實(shí)驗(yàn)選擇此劑量的X射線來建立SCN細(xì)胞輻射損傷模型。

關(guān)于輻射損傷的保護(hù)性藥物很多，有谷氨酸拮抗劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)和各種抗氧化劑等，但大部分效果并不理想。中藥類多糖對(duì)于機(jī)體受到輻射損傷能起到較好的恢復(fù)作用，枸杞多糖又是從中草藥枸杞中提取出來的一種高含糖類營(yíng)養(yǎng)成分。自噬相關(guān)蛋白LC3是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，當(dāng)自噬啟動(dòng)后，胞質(zhì)型LC3 I轉(zhuǎn)化到自噬體膜LC3 II，LC3 II/I越大，表明細(xì)胞自噬越高。大量文獻(xiàn)表明輻射損傷可以誘導(dǎo)自噬，如楊文軍等[6]用不同劑量的60Co照射小鼠精母細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，輻射組中電鏡可以觀察到大量的自噬小體，自噬蛋白LC3表達(dá)量增高，因此，輻射可以誘導(dǎo)自噬在精母細(xì)胞中發(fā)生。張志敏等[7]用射線處理HeLa細(xì)胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)與輻射劑量成正比關(guān)系，均提示在未達(dá)到致死劑量時(shí)，電離輻射是可以誘導(dǎo)自噬的。本實(shí)驗(yàn)也充分證明這一觀點(diǎn)，當(dāng)用10 Gy劑量X射線照射SCN細(xì)胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平在照射組明顯高于正常對(duì)照組。文獻(xiàn)報(bào)道LBP具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬的作用，如張多強(qiáng)等[8]研究表明LBP誘導(dǎo)自噬作用對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡起保護(hù)作用，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖；姜鳴等[9]研究表明LBP可以誘導(dǎo)LC3 I向LC3 II轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示輻射+LBP組細(xì)胞的LC3 II/I表達(dá)量較輻射組明顯升高，提示LBP可以誘導(dǎo)自噬蛋白LC3 II/I的表達(dá)。

綜上所述，我們采用X射線輻射SCN細(xì)胞建立損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)LBP對(duì)輻射造成的SCN細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)LBP能夠促進(jìn)由輻射損傷所致的SCN細(xì)胞發(fā)生自噬，其保護(hù)作用機(jī)制可能與LBP促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3 II/I表達(dá)有關(guān)，本研究進(jìn)一步提示LBP具有一定的抗輻射作用。