稀釋液中添加不同抗氧化劑對雞精液保存的影響

李 潔，董瑞生，王建福，楊 洋，虎 嘯，楊 禎，張永娥

（甘肅農業大學 動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070）

人工授精技術廣泛應用于牛、羊、豬、雞等家畜家禽養殖行業，精液的保存已成為人工授精技術中的重要環節，使得精液的保存和應用不再完全依賴時間、地域、種畜生命的限制。隨著現代科學技術的不斷發展更新，牛的人工授精技術幾乎全部采用冷凍精液來完成，而豬、羊、雞的精液保存絕大部分使用常溫（20～25℃）和低溫（2～5℃）保存方法。

隨著現代養禽業的快速發展，雞人工授精技術得到廣泛應用。而雞精液的稀釋與保存是人工授精技術發展的重要環節，能影響人工授精技術的好壞，該技術水平的高低直接影響優良種公雞的利用效率和養雞生產的經濟效益。精液只有經稀釋處理后，才能進行有效的保存和運輸，有利于優秀種公雞的資源共享。影響雞精液體外低溫保存效果的因素很多，如稀釋液的滲透壓、pH值、組成成分、雞精液的稀釋比例、保存溫度等（張兆旺，2005）[1]。在上述諸因素中稀釋液的組成成分直接影響以單細胞存在的精子的存活，以及雞精子體外低溫保存時的存活時間及保存后的受精力(胡日查，王玉寶等，1992)[2]。低溫保存精液可以延長精子在體外的存活時間，維持其受精能力，有利于長途運輸，擴大精液的使用范圍。

陳阮明等[3]在國內率先開展了雞精液體外低溫保存效果的研究，設計出的“北京家畜精液稀釋液（BJJX）”具有配置成份簡單、低溫保存效果良好等優點，在國內養雞業中得到推廣應用。因此，在雞精液的常溫或低溫保存技術中，如何延長精液的保存時間以擴大和提高優良種畜禽利用率就顯得極其重要（姚希芳，2002；張守權，2002）[4，5]。精液保存過程中，精子容易受傷，這與精子表面質膜被氧化的程度有關（陳阮明，廖紀朝等，2011）[6]。有試驗研究維生素C、維生素C鈉、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸四種抗氧化劑對雞精液保存的影響發現，通過向雞精液稀釋液中添加N-乙酰半胱氨酸可以有效延長雞精液的保存時間，在雞精液稀釋液的保存過程中主要對精子表面的質膜起到保護作用，從而可以保護精子（胡艷梅，白銀山等，2002）[7]。對于在精液稀釋液中添加維生素C、N-乙酰半胱氨酸來提高精液品質在豬和綿羊上已有研究和不同程度的應用（任峻嶺，2007；任峻嶺，2012）[8-10]，但在雞上還沒有相關研究。

本試驗對低溫下（2～5℃）保存的雞精液稀釋液通過添加不同濃度的維生素C、維生素C鈉、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸作為抗氧化劑保存，對試驗效果進行分組研究，以期找到能延長雞精液保存時間的方法，以便在實際生產中可以明顯提高優良種公雞的利用效率、提高養雞業生產的經濟效益。

1 試驗準備

基礎配方設計、準備試驗材料及化學藥品、稀釋液滲透壓的理論計算、申請實驗室等。

2 試驗材料

2.1 公雞精液

AA+白羽肉用型種公雞精液。

2.2 試驗儀器及用具

生物顯微鏡、萬分之一電子天平、冰箱、溫度計、恒溫水浴鍋、烘箱、容量瓶、燒杯、pH精確試紙、移液槍、載玻片、蓋玻片、離心管、移液管等。

2.3 化學藥品

維生素C、維生素C鈉、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸、果糖、L-谷氨酸鈉、檸檬酸鉀、乙酸鈉、氯化鎂。

3 試驗方法

配置1 000 ml基礎稀釋液，分裝為24組（維生素C、維生素C鈉各6個梯度，褪黑素、N-乙酰半胱氨酸各5個梯度，2個對照組），每組20 ml，各組分別添加不同濃度的四種抗氧化劑。

采集雞新鮮精液20 ml，用30組稀釋液按1∶3比例稀釋（每組用1.5 ml稀釋液稀釋0.5 ml精液，混合均勻后分為4個重復樣），在低溫（2℃～5℃）下保存，每天3次觀測并記錄精子活率，直至最后一個精子死亡，最后進行數據統計分析。

4 預試驗

4.1 基礎稀釋液配置

基礎稀釋液配方（g/1 000 ml）：果 糖（C6H12O6）1 g、L-谷氨酸鈉（C5H8NO4Na·H2O）1.92 g、檸檬酸鉀(K3C6H5O7·H2O)1.28 g、乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)8.5 g、 氯 化 鎂(MgCl2·6H2O)0.68 g，按照配方配制基礎稀釋液1 000 ml。[11]

4.2 分組及添加抗氧化劑

按表1中4種抗氧化劑不同的濃度進行配置，包括一個對照組，每個分組加入20 ml稀釋液溶解，然后保存到溶液瓶中，水浴鍋沸水消毒30 min，冷卻后加抗菌素保存。

4.3 雞精液采集與稀釋保存

從臨洮縣華加牧業公司采集新鮮雞精液20 ml,置于20℃左右的保溫杯中，經歷3 h的運輸后帶回實驗室，立即進行分組稀釋。

表1 四種抗氧化劑不同濃度分組（單位：mmol/L）

4.4 精子存活率觀測

將稀釋保存的精液取樣在生物顯微鏡下觀測精子存活率并記錄（取樣時應迅速，保證保存精液溫度變化不大），觀測結果如表2所示。

精子存活時間為檢查間隔時間的總和；精子生存指數指相鄰兩次精子存活率均數與間隔時間乘積的總和。從表2可知，維生素C和維生素C鈉的添加量過高，會導致pH值、滲透壓等變化過大而使精子死亡。

表2 精子生存指數和存活時間

5 正試驗

5.1 稀釋液配制（見表3）

基礎稀釋液的理論計算滲透壓為411 mOsm/L，用精密pH試紙測得基礎稀釋液的pH值為6.5。按照上述基礎稀釋液配方，計算出1 000 ml基礎稀釋液所要的各種化學試劑的量，稱量并置于100 ml的燒杯中，用蒸餾水溶解，定容在1 000 ml的容量瓶中，加入抗生素慶大霉素20萬IU/L。根據預試驗結果調整四種抗氧化劑至表4所示的濃度。

表3 基礎稀釋液配方

5.2 精液采集及稀釋

精液采集：10月7日從臨洮縣華加牧業公司采集新鮮雞精液20 ml,置于20℃左右的保溫杯中，在最短的時間內帶回實驗室（從精液采集到分組稀釋經歷3 h的運輸過程）。

精液稀釋：按1∶3的比例稀釋（精液1∶稀釋液3），即0.5 ml雞精液+1.5ml稀釋液，混勻，分為4個重復放入冰箱中保存，溫度控制在2～5℃。

5.3 精子存活率觀測

每天3次取樣，在顯微鏡下觀測精子存活率并記錄，詳見表5。

本次試驗分兩次進行，AB為第一次試驗，CD為第二次試驗，其中兩次試驗對照組生存時間及生存指數有很大差異，說明本試驗誤差很大。

圖1 添加維生素C組精子的存活時間和生存指數變化

表4 正試驗四種抗氧化劑不同濃度分組（單位：mmol/L）

表5 精子存活時間和生存指數

圖2 添加維生素C鈉組精子的存活時間和生存指數變化

圖3 添加褪黑素組精子的存活時間和生存指數變化

圖4 添加N-乙酰半胱氨酸組精子的存活時間和生存指數變化

從圖1至圖4可看出：A組（維生素C）在0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L濃度下低溫保存的存活時間沒有明顯變化，之后隨濃度的增加而降低；生存指數對照組明顯高于試驗組，而且生存指數隨著濃度的增大而降低。

B 組（維生素C鈉）在0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 濃度下低溫保存的存活時間沒有明顯變化，在2 mmol/L、4 mmol/L 濃度下存活時間明顯低于對照組；生存指數在0.5 mmol/L濃度下與對照組差異不大，在2 mmol/L、4 mmol/L 濃度下明顯低于對照組。

C組（褪黑素）的存活時間曲線呈谷峰式波動，0.003 mmol/L濃度下存活時間較長，說明該濃度對雞精液低溫保存時間有延長作用，但濃度高于0.003 mmol/L時出現抑制作用；生存指數隨濃度增加呈先升后降趨勢，0.001 mmol/L對雞精液低溫保存有積極作用，添加的褪黑素隨濃度增加對雞精液保存有一定抑制作用。

D組（N-乙酰半胱氨酸）精子的保存時間在 0.25 mmol/L 濃度下最長達220 h，0.5 mmol/L后隨著濃度的增加呈下降趨勢；生存指數在0.25 mmol/L、0.5 mmol/L 濃度下相對較高，隨著濃度的繼續增加，精子的生存指數逐漸降低，0.5mmol/L時精子生存指數有明顯的提高。

6 討論與分析

6.1 維生素C和維生素C鈉

陳宗明，密國輝等（2012）[12]研究表明稀釋液中添加維生素C能顯著提高精子活力，提高精液品質，Mustafa等［13］研究發現，在羊精液低溫保存時，稀釋液中的維生素C含量低于200 μg/ml對精子活力無明顯影響，當添加濃度達到500～1 000 μg/ml時，可顯著延長精子的存活時間。本試驗結果表明，稀釋液中添加了抗氧化劑維生素C和維生素C鈉的試驗組與未添加抗氧化劑的對照組的精子存活時間、精子生存指數等沒有明顯差異，這與上述陳宗明，密國輝等的試驗結果不一致。可能的原因有：試驗中Vc及Vc鈉濃度設計不合理，試驗過程操作不熟練，導致試驗誤差太大。

6.2 褪黑素

褪黑素（melatonin，mlT）在醫學領域具有抗氧化等方面的生理功能，可以保護細胞的膜脂質、蛋白質、核酸和其他成分[14]。經李博玲等試驗研究發現，0.25 mg/ml褪黑素可以顯著提高精子的活率、活力、線粒體活性及頂體完整性[15]。本試驗所得結論 ：0.001 mmol/L、0.003 mmol/L、0.009 mmol/L、0.027 mmol/L、0.081 mmol/L 濃度比較中，0.003 mmol/L對雞精液保存有明顯作用，但隨濃度增加對雞精液保存有一定抑制作用。

6.3 N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸與H2O2、OH-、次氯酸等的結合可以明顯降低細胞中活性氧自由基濃度，以保護細胞內生物大分子免受活性氧（ROS）引起的氧化性損傷［16］。通過向稀釋液中添加帶巰基物質可抵抗這種氧化壓力，對保護精子質膜及抑制精子獲能等有重要作用[17]，從而降低精子氧化代謝速度。魏世寶（2007）[10]研究發現在冷凍稀釋液中添加1 mmol/L的N-乙酰半胱氨酸可顯著地提高解凍后精子的活率和頂體完整率，降低精子的低滲膨脹百分率，邱自貴（2016）[18]研究表明在稀釋液中添加N-乙酰半胱氨酸可以極顯著延長雞精液低溫保存時間，與該試驗結果相近，即添加0.25 mmol/L、0.5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸可以明顯提高精子生存指數及延長精子的存活時間，但濃超過1 mmol/L則不利于精子生存指數和存活時間的提高。