甘南牦牛線粒體DNA Cytb基因序列分析

劉吳鑫，馬博妍

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

甘南牦牛是主要產(chǎn)于我國(guó)3 000～5 000 m 的高山、亞高山地區(qū)草原上的一種特有家畜，主要分布在甘肅省甘南藏族自治州，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤狻⑷椤⒚壬a(chǎn)生活必需品，在遺傳資源上是一個(gè)極為寶貴的基因庫(kù)。線粒體DNA(mtDNA)是細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，主要以母系遺傳方式遺傳，可以作為研究物種起源進(jìn)化和重建物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的遺傳標(biāo)記手段[1]。線粒體 DNA 細(xì)胞色素 b（cytochrome b, Cytb） 基因是線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中結(jié)構(gòu)功能研究最為透徹的基因，尤以進(jìn)化速度較快為特點(diǎn)，在昆蟲(chóng)遺傳進(jìn)化研究中已有較多的應(yīng)用[2-3]。因此，線粒體DNA也可用于甘南牦牛高原環(huán)境適應(yīng)性等方面的研究[4]。本研究采用DNA池和直接測(cè)序法預(yù)獲得甘南牦牛線粒體DNA Cytb基因全序列，從分子水平分析其理化性質(zhì)，旨在為我國(guó)牦牛的起源、遺傳多樣性等研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘肅省夏河縣屠宰場(chǎng)采集甘南牦牛血樣75份，醫(yī)用采血管保存。采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法進(jìn)行基因組DNA提取，去離子水溶解稀釋。牦牛DNA母液各取5μL構(gòu)建DNA混合池，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

依據(jù)Gen Bank公布的普通牛mtDNA Cytb基因序列（No：NC_006853），利用Primer6.0和Lasergene軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物擴(kuò)增DNA混合池。引物序列：F∶5’-CCATAAATAGGTGAAGGTTTCG-3’，R∶5’-TTGATGGTGAGACTGCAGTT-3’，并送至蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行合成。

1.3 PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序

PCR擴(kuò)增體系總體積為40 μL：DNA模板2.0 μL，0.25μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 22.0 μL，雙蒸水14.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?：95 ℃ 預(yù)變性4 min ；95 ℃ 變性30 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4℃保存，1%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后送至蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNA Star軟件比對(duì)和拼接獲得甘南牦牛mtDNA Cytb基因序列。

1.4 牦牛mtDNA Cytb基因序列分析

甘南牦牛mtDNA Cytb基因理化性質(zhì)分析依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]介紹的在線軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘南牦牛mtDNA Cytb基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

甘南牦牛mtDNA Cytb基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增片段大小為1 401 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段相符，電泳條帶清晰，特異性良好。

圖1 牦牛mtDNA Cytb基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖檢測(cè)

2.2 甘南牦牛mtDNA Cytb基因編碼氨基酸組成分析（圖2）

獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 401 bp，利用NCBI的ORF Finder程序預(yù)測(cè)獲得甘南牦牛mtDNA Cytb 編碼區(qū)1 140 bp 的開(kāi)放閱讀框（ORF），起始密碼子ATG，終止密碼子AGA，推測(cè)甘南牦牛mtDNA Cytb基因編碼379個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。牦牛編碼產(chǎn)物mtDNA Cytb基因分子質(zhì)量約為98.5 KD，理論等電點(diǎn)為4.98。20種氨基酸組成中，半胱氨酸(Cys)占全部氨基酸組成的1.1%(4個(gè))，亮氨酸（Leu）占全部氨基酸組成的15.8%(60個(gè))。整個(gè)蛋白帶正電荷，其中正電荷30個(gè)，負(fù)電荷17個(gè)。堿性氨基酸18個(gè)，酸性氨基酸40個(gè)，非極性氨基酸215個(gè)，疏水性氨基酸182個(gè)。氨基酸殘基中負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為17，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為18。分子式為C3555H5972N1140O1429S343，不穩(wěn)定指數(shù)為31.23。甘南牦牛mtDNA Cytb基因序列中，A、T、G、C堿基含量分別為31.23%、13.42%、25.26%和30.09%。A+T含量為56.49%，明顯高于G+C含量（43.51%）。AT偏倚度為0.1056，GC偏倚度為-0.3831。

圖2 甘南牦牛mtDNA Cytb蛋白氨基酸組成預(yù)測(cè)

3 討論

基因通過(guò)蛋白質(zhì)決定生物的性狀。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明：甘南牦牛線粒體DNA Cytb編碼蛋白由379個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成；分子式為C3555H5972N1140O1429S343，分子質(zhì)量較大（98.5KD），理論等電點(diǎn)為4.98。依據(jù)氨基酸分值越高疏水性越強(qiáng)，相反親水性越強(qiáng)的原則，推測(cè)甘南牦牛線粒體DNA Cytb編碼蛋白屬于親水性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)值小于40(31.23)，表明該編碼蛋白較穩(wěn)定。20種氨基酸組成中，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的亮氨酸（Leu）數(shù)目最多為60個(gè)，對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用的半胱氨酸（Cys）數(shù)目最少為4個(gè)，說(shuō)明甘南牦牛線粒體DNA Cytb編碼蛋白質(zhì)中的半胱氨酸高度保守。正電荷殘基為30個(gè)，負(fù)電荷殘基為17個(gè)，表明甘南牦牛線粒體DNA Cytb編碼蛋白質(zhì)帶正電。氨基酸殘基中負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為17，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為18。

甘南牦牛線粒體DNA Cytb基因序列中，堿基A平均含量最高（31.23%），堿基T平均含量最低（13.42%）。A+T含量（56.49%）高于G+C含量（43.51%），存在明顯的AT使用傾向性，這一特征符合大部分哺乳動(dòng)物線粒體DNA AT含量偏高的論點(diǎn)。AT偏倚度為0.1056，GC偏倚度為-0.3831，這與蔡欣等[6]的研究結(jié)果不一致。蔡欣等[7]研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)普通牛線粒體Cytb基因表現(xiàn)出堿基組成偏好（0.45）以及平均整體AT含量最高（56.7%）。這可能是由于甘南牦牛與普通牛生活地域的差異導(dǎo)致二者在Cytb基因序列上的不同，這與甘南牦牛高原低氧適應(yīng)性是否有關(guān)還得進(jìn)一步進(jìn)行探究。