膠質瘤致病相關蛋白1對肺癌A549細胞生長及分化的影響

生秀梅，黃新祥， 王正新

1)江蘇大學醫學院生物化學教研室 江蘇鎮江 212013 2)克拉克亞特蘭大大學生物科學系；克拉克亞特蘭大大學癌癥研究與治療發展中心 美國亞特蘭大 30314

肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一；目前肺癌的治療仍以手術為主，但術后預后差，生存期短，因此迫切需要找到新的診療方法或研制出新的診療試劑[1-2]。膠質瘤致病相關蛋白1(glioma pathogenesis-related protein 1， GLIPR1)基因是從膠質細胞瘤中克隆出來的新基因[3-4]，屬于富含半胱氨酸分泌蛋白CAP家族[5]。GLIPR1蛋白有一段信號肽和一段跨膜區段，被認為是一種分泌蛋白[5-6]。在前列腺癌和膀胱癌等腫瘤中，GLIPR1具有抑癌作用，受p53調節，其過表達可誘導多種前列腺腫瘤細胞的凋亡[7-9]。有報道[10]指出GLIPR1在正常肺細胞中表達較高，但在肺癌細胞中的表達較低。因此，本研究擬通過慢病毒感染使肺癌A549細胞高表達GLIPR1蛋白或GLIPR1胞外可溶性區段(GLIPR1-S)，探索GLIPR1對A549細胞生長和分化的影響，以期為肺癌藥物的研制提供線索。

1 材料與方法

1.1材料pCDH-FLAG由本室構建(構建所用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒載體系統購自SBI公司)；A549細胞、293T細胞及E.coliXL 10-gold感受態細胞由本室保存。人GLIPR1cDNA克隆 (HsCD00441029) 購自DNASU公司，肺表面活性蛋白C(SPC)抗體購自Millipore公司，anti-β-actin抗體購自Sigma公司，二抗山羊抗大鼠Alexa 595抗體購自Invitrogen公司，anti-GLIPR1抗體購自Abnova公司，細胞染色劑SYTOX GREEN購自美國Molecular Probes公司，Histogel凝膠購自Linaris公司。

1.2GLIPR1、GLIPR1-S重組慢病毒載體的構建根據GLIPR1序列(HQ447422)設計并合成上下游引物，分別在上下游引物的5’端加接EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點序列；為了增加蛋白的表達，在上游引物GLIPR1起始密碼子AUG前添加ACC堿基[11-13]。GLIPR1、GLIPR1-S共用同一上游引物GLIPR1-F：5’-GGAATTCACCATGCGTGTCACACTT GCTACAATAG-3’ (下劃線為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物GLIPR1-R：5’-CGGGATCCTGAATTGTATT AGTCCAAAAG-3’，GLIPR1-S-R：5’-CGGGATCCTTATCTGTTACGTGGATATATGGGCC -3’(下劃線為BamHⅠ酶切位點)。以含有GLIPR1 cDNA克隆的質粒為模板，分別以GLIPR1-F/R及GLIPR1-F/GLIPR1-S-R為引物，通過PCR獲取目的基因GLIPR1和GLIPR1-S。膠回收后和pCDH-FLAG分別經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶室溫連接過夜，將連接產物轉化至E.coliXL 10-gold，次日從含氨芐西林的LB平板上挑取6個菌落，接種于4 μL含氨芐西林的LB培養液中，37 ℃過夜培養，提取質粒。經雙酶切驗證及DNA測序分析最終確認，分別為pCDH-GLIPR1-FLAG和pCDH-GLIPR1-S-FLAG。

1.3重組慢病毒的包裝及濃縮應用LipofectamineTM2000將pCDH-GLIPR1-FLAG和pCDH-GLIPR1-S-FLAG質粒、包裝結構質粒psPAX2和包膜質粒pMD2.G按質量比4∶3∶1的比例混合，共轉染對數生長期的293T細胞。轉染24 h后，更換新鮮培養基10 mL，48 h后，收集細胞上清液(含慢病毒Lenti-GLIPR1、Lenti-GLIPR1-S)，用0.45 μm濾膜過濾掉細胞殘片，密封后4 ℃保存。分別用1、5、10、30、50、100 μL的病毒液，感染均勻平鋪于6孔板的293T細胞，72 h后通過觀察細胞的熒光效率測得病毒滴度為6×109PFU/mL。

1.4重組慢病毒感染細胞實驗及細胞活力測定將A549細胞接種于24孔板，以含體積分數10%胎牛血清的MEM培養液培養。第2天細胞融合度達到70%～80%時，換含上述2種重組慢病毒顆粒懸液30 μL的新鮮培養基1 mL，加入終濃度為8 mg/L的Polybrene以增加感染效率。同時設立Lenti-pCDH空病毒組。轉染16 h后，換含體積分數10%胎牛血清的MEM培養液培養。感染第3天轉至100 mm培養皿繼續培養3 d，計數細胞。

1.5感染重組慢病毒的A549細胞GLIPR1和GLIPR1-S蛋白表達的檢測采用Western blot法。 收集1.4中細胞，用蛋白裂解液裂解后離心取上清，測定濃度后，以各泳道上樣量10 μg進行120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至聚偏二氟乙烯膜上，用含30 g/L脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，分別用多克隆抗體anti-GLIPR1(1∶1 000稀釋)、anti-β-actin(1∶5 000稀釋)和對應的二抗進行免疫標記，ECL顯色，全自動凝膠成像系統進行曝光。

1.6感染重組慢病毒的A549細胞的分化情況觀察采用免疫細胞化學法。 將Lenti-GLIPR1或Lenti-pCDH空病毒感染的A549細胞接種于細胞計數板，以含體積分數10%胎牛血清的MEM培養液培養過夜。第2天，吸去培養液，PBS洗細胞后，用冷甲醛(-20 ℃)固定10 min， 體積分數4%魚膠(PBS配制)阻斷非特異性染色，20 min后移去魚膠，加SPC抗體(1∶50稀釋)、anti-GLIPR1抗體(1∶100稀釋，魚膠配制)孵育過夜，加山羊抗大鼠Alexa 595抗體(1∶500稀釋) ，室溫孵育1 h， PBS洗細胞后，用SYTOX GREEN室溫對比染色10 min，用Histogel封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1pCDH-GLIPR1及pCDH-GLIPR1-S的鑒定通過PCR擴增分別獲得全長813 bp的GLIPR1片段和711 bp的GLIPR1-S片段。將目的片段插入慢病毒載體pCDH構建成pCDH-GLIPR1和pCDH-GLIPR1-S，轉化E.coliXL 10-gold，挑取單克隆，提取質粒，用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，電泳可見800 bp和700 bp左右的片段，DNA測序亦完全正確，表明pCDH-GLIPR1和 pCDH-GLIPR1-S構建成功，見圖1。

1:GLIPR1-S擴增產物；2：GLIPR1擴增產物；M：Marker；3：pCDH-GLIPR1-S酶切結果；4：pCDH-GLIPR1酶切結果

圖1重組慢病毒載體的構建(左)和酶切鑒定(右)

2.2感染重組慢病毒的A549細胞GLIPR1和GLIPR1-S蛋白的表達Western blot結果顯示A549細胞經Lenti-GLIPR1和Lenti-GLIPR1-S感染后，均可表達相應蛋白(圖2)。

1：空病毒組；2：感染Lenti-GLIPR1組；3：感染Lenti-GLIPR1-S組

圖2Westernblot檢測結果

2.3感染重組慢病毒的A549細胞的生長分化情況與空病毒組[(63.872±6.376)×105]相比，感染Lenti-GLIPR1、Lenti-GLIPR1-S第6天的A549細胞數分別為(7.167±1.750)×105和(2.167±1.102)×105，說明感染后細胞生長受抑(F=235.500,P<0.001)。與空病毒組相比，感染Lenti-GLIPR1 的A549細胞明顯變大(圖3A、B)。共聚焦顯微鏡下可見GLIPR1主要定位于A549細胞的細胞質(綠色為核，紅色為GLIPR1， 圖3C)，細胞中SPC增多(圖4，綠色為核，紅色為SPC)，說明GLIPR1表達可促進A549細胞向肺上皮細胞分化。

A：空病毒組(×400)；B：感染Lenti-GLIPR1組(×400)；C：GLIPR1在感染Lenti-GLIPR1的A549細胞中的分布(免疫熒光染色)

A：空病毒組；B：感染Lenti-GLIPR1組

3 討論

GLIPR1蛋白又稱RTVP-1，是富含半胱氨酸分泌蛋白CAP家族的一員[5]。GLIPR1蛋白包含一段信號肽和一段跨膜區段。氨基末端的前21個氨基酸殘基組成了GLIPR1前體蛋白的信號肽，而羧基末端的氨基酸殘基則構成了跨膜區段[5,14]。GLIPR1早期作為原癌基因發現于人神經膠質瘤中[3],其高表達可促進神經膠質瘤的增殖、存活、侵襲及轉移[15]。但是，在前列腺癌細胞中，GLIPR1表達較低，為p53調節基因，GLIPR1的高表達可產生活性氧，從而導致多種前列腺腫瘤細胞的凋亡[7-9]。將腺病毒載體介導的GLIPR1基因直接注射于鼠前列腺癌組織可抑制腫瘤組織的生長[16]。亦有用腺病毒載體介導的GLIPR1基因疫苗治療鼠前列腺腫瘤的研究[17]。為了檢測可溶性GLIPR1區段是否具備GLIPR1的抑癌活性，本研究同時構建了重組慢病毒Lenti-GLIPR1-S(GLIPR1去除跨膜區段)，其蛋白包括GLIPR1蛋白的前1～232個氨基酸殘基。結果顯示，感染Lenti-GLIPR1和Lenti-GLIPR1-S的A549細胞中GLIPR1蛋白的表達均升高，而A549細胞的生長受抑；進一步研究發現，GLIPR1高表達可使A549細胞變大，促進細胞中SPC的表達，提示A549細胞向肺上皮細胞分化。推測感染Lenti-GLIPR1和Lenti-GLIPR1-S均可促進A549細胞向肺上皮細胞分化，抑制A549細胞的生長。后續研究可著重于使用可溶性GLIPR1蛋白進行臨床藥物研制。