高遷移率族蛋白2在肝癌組織中的表達及對肝癌細胞生物學活性的影響

陳建安，陳思玉，劉麗文，朱威威，陳曉龍，余 炎，何玉婷，孫冉冉，任志剛，李 娟，崔光瑩，余祖江

鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州450052

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是我國最常見和致死率較高的惡性腫瘤之一[1]。其惡性程度高，進展快，除了早期外科手術切除外，放、化療多不能取得滿意的療效，且預后極差[2]。因此，探索HCC發生、發展的分子機制，尋找新的預后判斷標志物和治療靶點，對提高HCC治愈率具有重要的臨床意義。

高遷移率族蛋白(high mobility group box,HMGB)是真核細胞核內一類含量豐富的核蛋白，功能多樣。在細胞中，作為核DNA結合蛋白，HMGB1和HMGB2高度保守[3-4]。作為細胞外成分，HMGB家族與敗血癥、關節炎、癌癥等疾病關系密切[5]。HMGB1在各種人類癌癥中過表達，包括前列腺癌、人腦膠質瘤[6]、前列腺癌[7]、結直腸癌[8]和乳腺癌[9]等。更重要的是，HMGB優先結合順鉑(Ⅱ)二酰氯(順鉑)修飾的DNA或錯誤摻入的核苷類似物，并因此抑制核苷酸切除修復，這可能對于癌癥治療很有價值[10]。目前對HMGB2的研究相對較少，主要集中在胃癌[11]、乳腺癌[12]等。本研究利用癌癥基因組圖譜(TCGA)和GEO公共數據庫驗證HMGB2在HCC組織中的表達及其對預后的影響，同時分析了HMGB2對HCC細胞增殖、侵襲及凋亡、周期的影響，探討其對HCC發展預測和靶向治療的價值。

1 材料與方法

1.1TCGA和GEO公共數據庫有關HCCHMGB2表達譜數據的分析

1.1.1 數據下載及過濾 下載TCGA數據庫中的HCC相關數據。根據表達譜數據，對HMGB2 mRNA表達由低到高排序，低于中位數節點的樣本為低表達組，高于中位數節點的樣本為高表達組。下載GEO數據庫中7個數據集(GSE76297，GSE10143，GSE14520，GSE25097，GSE36376，GSE102083，GSE57957)中有關HCC HMGB2 mRNA表達譜文件。數據過濾方法參見文獻[13]。

1.1.2富集分析(genesetenrichmentanalysis，GSEA) 采用 GSEA 2.2.1分別對TCGA數據庫中HMGB2 mRNA低表達組和高表達組進行分析。利用 GSEA網站 MsigDB數據庫獲得 c2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt數據集，然后按缺省加權富集統計的方法進行富集分析，隨機組合次數為 1 000。

1.2細胞實驗主要試劑及儀器人正常肝細胞LO2、HCC細胞株SMMC7721和Hep3B購自中國科學院細胞庫。DMEM培養基購自美國Gibco公司，標準胎牛血清購自美國HyClone公司，HMGB2抗體和β-actin抗體購于武漢三鷹公司，HMGB2 siRNA(序列為5’-CUGAACAUCGCCCAAAGAU-3’)及陰性對照(NC)siRNA(序列為5’-UUCUCCGAACGU GUCACGUTT-3’)由上海吉瑪制藥公司設計合成，脂質體轉染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，CCK-8試劑購于日本同仁公司，Matrigel膠和Transwell小室購于BD公司，細胞周期和細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司。

1.3HMGB2siRNA轉染后HCC細胞生物學活性的檢測

1.3.1 細胞培養及轉染 細胞復蘇后，用含體積分數10% 胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，在37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。待細胞融合度達80%～90%時，取狀態好的細胞用于后續實驗。分別收獲對數生長期的SMMC7721和Hep3B細胞接種于6孔板，用Lipofectamine2000分別轉染HMGB2 siRNA、NC siRNA并設置空白對照,48 h后進行后續實驗。

1.3.2 HMGB2蛋白的檢測 用RIPA裂解蛋白提取試劑(中國碧云天公司)和蛋白酶抑制劑(美國羅氏公司)收集細胞和細胞裂解物，取等量蛋白行100 g/L SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜(Millipore，USA)上，用含50 g/L脫脂乳和TBS緩沖液封閉1 h，加HMGB2抗體(按1∶1 000稀釋)、內參β-actin抗體(按1∶5 000稀釋)，4 ℃搖床過夜，TBST洗滌3次，經二抗孵育1 h和洗滌后，將膜暴露，用Labwork對蛋白條帶進行灰度分析。以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖 將轉染24 h后的細胞以每孔5×104個/mL的密度接種于96孔板，培養24、72和120 h后分別進行CCK-8實驗。檢測波長450 nm。每組3個復孔。

1.3.4 Transwell 體外遷移實驗 選用孔徑為8 μm 的24孔 Borden 小室，上室加入1×105個細胞，總體積200 μL，下室加入300 μL含血清培養基，每組設置3個復孔。48 h后取出小室，甲醇固定并用結晶紫染色孵育10 min以去除上層小室側的未遷移細胞。顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍攝，計算每個視野的平均細胞數。

1.3.5 細胞凋亡和細胞周期的檢測 轉染48 h后收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，加入1×binding buffer 重懸細胞并調整細胞濃度為1×106個/mL，離心棄上清，用適量1×binding buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料混勻后避光孵育15 min，上流式儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。轉染48 h后收集細胞，PBS洗2遍，2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心棄上清，加入冰預冷的體積分數70%的乙醇4 ℃孵育1 h。1 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS 2 mL重懸細胞。再加入300 μL PI，4 ℃下避光孵育30 min，上流式儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.4統計學處理使用 SPSS 17.0和GraphPad Prism 5進行統計學分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并行log-rank檢驗；HCC組織和癌旁正常組織中,以及不同臨床病理特征的HCC組織中HMGB2 mRNA表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗；3組細胞中HMGB2蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1TCGA及GEO數據庫數據分析結果

2.1.1 HCC組織中HMGB2 mRNA的表達特點 TCGA數據集及GEO數據集分析結果(表1)顯示，患者年齡中位數為59歲；HCC組織中HMGB2 mRNA表達水平較癌旁正常組織升高。TCGA數據集數據分析結果顯示，HCC組織中HMGB2 mRNA表達水平與種族、甲胎蛋白表達水平、TNM分期及分化程度有關，與種族、性別、 年齡無關(表2)；針對總體生存(overall survival，OS)、無進展生存(progression-free survival，PFS)的生存分析結果顯示，HMGB2 mRNA高表達組預后差于低表達組(圖1，χ2分別為8.162、4.819，P分別為0.028、0.004)。OS時間指從隨機化開始至因任何原因引起死亡的時間，PFS時間指從隨機化開始到患者現腫瘤進展或死亡的時間。

表1 GEO和TCGA公共數據庫中HCC及癌旁正常組織中HMGB2 mRNA表達水平的比較

表2 不同臨床病理特征的HCC組織中HMGB2 mRNA表達水平的比較

*：數據有缺失

圖1 HMGB2 mRNA高、低表達組OS(上)、PFS(下)生存曲線

2.1.2 GSEA分析 GSEA 結果提示HMGB2 高表達樣本富集到細胞周期、DNA復制、RNA降解等基因集，見圖2。

從上到下依次為細胞周期(FDR=0.06)、DNA復制(FDR=0.12)、RNA降解(FDR=0.14)、錯配修復(FDR=0.20)

圖2GSEA分析結果

2.2HMGB2蛋白在HCC細胞中的表達見圖3和表3、4。Western bolt結果顯示，SMMC7721和Hep3B細胞中HMGB2蛋白表達水平高于正常肝細胞LO2；轉染HMGB2 siRNA的SMMC7721、Hep3B細胞中HMGB2蛋白表達水平低于空白對照組和NC組。

圖3 HMGB2蛋白的檢測

2.3 3組細胞增殖、侵襲能力的比較轉染HMGB2 siRNA 之后，SMMC7721和Hep3B的增殖、侵襲能力均低于NC組和空白對照組，見圖4、5和表3、4。

圖4 細胞增殖曲線

圖5 細胞侵襲實驗結果(×100)

2.4 3組細胞細胞周期、凋亡率的比較見表3、4。HMGB2 siRNA 轉染的SMMC7721和Hep3B細胞被阻滯在G0/G1期，細胞凋亡率高于NC組和空白對照組。

表3 3組SMMC7721細胞HMGB2蛋白表達水平、穿膜細胞數、細胞周期和凋亡率的比較

*:與空白對照組和NC組相比，P<0.05

表4 3組Hep3B細胞HMGB2蛋白表達水平、穿膜細胞數、細胞周期和凋亡率的比較

*:與空白對照組和NC組相比，P<0.05

3 討論

HCC是我國發病率最高的惡性腫瘤之一，由于其發病隱匿，早期無明顯不適，且極易發生遠處轉移、血管侵襲和復發，診斷和治療難度很大[14]。大多數患者在確診時已是晚期，失去了最佳治療時機，因此，探索能夠提示早期HCC的分子指標具有重要臨床意義。

HMGB2是較為保守的HMGB家族成員，有報道[15]認為高表達的HMGB2 在胚胎發育過程中具有重要作用，但在成人主要在淋巴器官和睪丸中表達。此外，在關節表面區域的軟骨細胞中HMGB2亦高表達，敲除HMGB2基因后極易發展為骨關節炎[16]。近年來，多項研究證明HMGB2 在胃癌、膠質母細胞瘤和胰腺癌等腫瘤中呈現高表達，并且在腫瘤細胞增殖、侵襲轉移中發揮重要作用。Li等[11]發現沉默HMGB2后，胃癌細胞MKN45的增殖能力被抑制，PCNA和Ki-67表達減少。Wu等[17]的研究表明HMGB2促進膠質母細胞瘤的增殖、侵襲，并與預后生存相關。Cai等[18]證實沉默HMGB2后，胰腺癌細胞增殖能力下降，并且HMGB2參與維持胰腺癌細胞的糖酵解進程。

本研究利用GEO和TCGA數據集證實HMGB2 mRNA在HCC組織中高表達，并且與甲胎蛋白表達水平、TNM分期、分化程度有關，即惡性程度越高，HCC組織中HMGB2 mRNA的表達越高。更重要的是，本研究發現HCC組織中HMGB2 mRNA的表達與預后關系密切，高表達患者預后差，這與Kwon等[19]的研究結果一致。有報道[20]稱細胞周期的調控與腫瘤發生發展具有密不可分的關系，細胞周期調控機制受損導致細胞惡性增殖、凋亡異常、侵襲性增加。本研究利用GSEA方法發現，HMGB2 mRNA的表達與細胞周期、DNA復制、 RNA降解等有關，推測HMGB2可能是通過參與細胞周期調控和侵襲轉移影響HCC細胞的生存。我們進一步利用細胞實驗證實，HMGB2蛋白在HCC細胞SMMC7721和Hep3B中高表達；利用siRNA下調SMMC7721和Hep3B細胞中HMGB2的表達后，細胞增殖能力受到抑制，侵襲能力下降，細胞凋亡率升高；G0/G1期細胞增多，S期細減少，G2/M期細胞亦減少。這些結果再次提示HMGB2 有可能成為HCC臨床預后評價指標，并可能成為腫瘤治療的潛在靶點。

綜上所述，HMGB2的異常表達可能與HCC細胞的增殖、侵襲、凋亡等密切相關，可作為一個潛在的HCC發展的預測指標，為HCC靶向治療提供了一定參考價值。