抑制ERBB2基因對肝癌HepG2細胞生長及PI3K/AKT信號通路的影響

顧 清，張 莉，張新星，代小松，陳和平

四川省醫學科學院(四川省人民醫院)老年消化科 成都 610072

肝癌是一種常見的癌癥，也是全世界癌癥相關死亡的第三大原因。研究[1]表明，每年檢測到超過60萬例原發性肝癌新病例。盡管肝癌患者的5 a生存率有所提高，但肝癌患者的預后較差[2]。由于對目前可用的化療藥物的耐藥性和對放射療法的耐受性，肝癌很容易向其他組織如肺、淋巴結、骨骼和腎上腺等發生轉移[3]。因此，需要開發新的和有效的肝癌治療策略。隨著分子生物學的發展，目前已證實[4]肝癌是一系列多基因引發的疾病。從基因層面上探究其發病機制可為肝癌治療提供有效的作用靶點。ERBB2基因又稱HER2基因，具有廣泛調節細胞生長、增殖、分化和凋亡的功能[5]。目前研究[6-8]顯示，ERBB2基因的過表達與多種腫瘤的發生發展密切相關。ERBB2基因在乳腺癌[6]、卵巢癌[7]、胰腺癌[8]等多種腫瘤組織中異常高表達。靶向抑制ERBB2表達能夠抑制乳腺癌細胞的生長和侵襲[9]。多種因素能夠通過下調ERBB2表達誘導胃癌細胞發生凋亡，抑制細胞增殖和生長[10-11]。多項研究[12-13]顯示，ERBB2能夠通過調控PI3K/AKT通路調控癌細胞增殖和侵襲等生物學過程。PI3K/AKT信號通路與腫瘤的發生和發展密切相關，抑制該信號通路能夠抑制癌細胞增殖，促進細胞凋亡[14]。近期研究[15]發現，ERBB2在肝癌組織中呈高表達，提示ERBB2可能參與肝癌的發生和進展。但目前國內外關于ERBB2在肝癌發生發展中的功能研究仍較少，因此本實驗通過RNA干擾技術抑制人肝癌細胞HepG2中ERBB2的表達，進一步探究其對肝癌細胞生長的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細胞系HepG2(中國科學院上海細胞庫)；RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司)；由上海吉瑪制藥有限公司構建ERBB2 siRNA(序列為5’-GATCCGAGATCACAGGTTACCTATTTCAAGCGAATAGGTAACCTGTGATCTCTTTTTT GGAAA-3’)；PI/RNase染色試劑盒(美國BD公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；CCK-8試劑(日本同仁化學研究所)；Trizol試劑、SYBR Primix Ex Taq(大連寶生物工程有限公司)；反轉錄試劑盒(德國Thermo Fisher公司)；增殖細胞核抗原(PCNA)抗體、AKT抗體和p-AKT抗體(美國CST公司)；PVDF膜、HRP標記的二抗(北京康為世紀生物科技有限公司)；ECL顯色試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)。

1.2細胞培養人肝癌細胞HepG2培養在含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，置體積分數為5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養箱中，每隔1～2 d更換1次新鮮培養液，待細胞融合度達約90%時，采用2.5 g/L胰蛋白酶進行消化傳代，每1～2 d傳代1次，取對數生長期的HepG2細胞進行后續實驗。

1.3細胞轉染和分組轉染前1 d將肝癌HepG2細胞以胰蛋白酶消化，種植在6孔板中，種植密度為4×105個/孔，在37 ℃培養箱中繼續培養。待細胞融合度約為60%時進行轉染，ERBB2 siRNA和siRNA對照的轉染均采用Lipofectamine 2000，轉染過程嚴格按照轉染試劑說明書進行操作。將轉染ERBB2 siRNA的HepG2細胞記為ERBB2-siRNA組，將轉染siRNA 對照的HepG2細胞記為Con-siRNA組，將不經任何處理的HepG2細胞記為空白對照組。轉染后置37 ℃培養箱中繼續培養24 h，然后進行相應檢測。

1.4qRT-PCR檢測細胞中ERBB2mRNA表達水平轉染24 h后分別收集各組HepG2細胞，以Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，測定RNA濃度和純度后，選取合格的RNA進行反轉錄，反轉錄過程加樣及程序設置均按照試劑盒說明書進行操作。以反轉錄合成的cDNA為模板，采用SYBR Primix Ex Taq進行PCR擴增。ERBB2引物序列：上游引物5’-TGGAGGACAAGTAATGATCTCCTGG-3’，下游引物5’-AAGAGAGACCAGCAGCCCAGACCTG-3’；內參β-actin引物序列：上游引物5’-CATCTCTT GCTCGAAGTC-3’，下游引物5’-AAGGATTCCTAT GTGCCC-3’。實驗采用20 μL反應體系。反應程序：95 ℃ 30 s，1個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。反應結束后統計Ct值，采用2-ΔΔCt法計算ERBB2 mRNA相對表達量。實驗重復3次。

1.5Westernblot測定細胞中ERBB2、PCNA、AKT和p-AKT蛋白表達水平分別收集轉染24 h后各組細胞，加入適量RIPA蛋白裂解液置冰上提取細胞中總蛋白。采用BCA法測定提取蛋白的濃度，加入上樣緩沖液與蛋白混合，沸水浴15 min使蛋白變性，取等量蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，電泳結束后以半干法電轉至PVDF膜上，用100 g/L脫脂奶粉液封閉2 h。分別用一抗4 ℃過夜雜交：ERBB2抗體1∶1 000稀釋，PCNA抗體1∶500稀釋，AKT抗體1∶800稀釋，p-AKT抗體1∶800稀釋。TBST洗膜3次，二抗(1∶5 000稀釋)室溫雜交1 h。TBST洗膜3次，ECL化學發光顯色。以GAPDH標定，采用Image J圖像分析軟件計算各組細胞中ERBB2、PCNA、AKT和p-AKT蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.6CCK-8法檢測細胞增殖能力取對數生長期的肝癌HepG2細胞，以每孔3×103個細胞接種于96孔板中，置37 ℃培養箱繼續培養24 h，待細胞貼壁生長融合度為50%～60%時進行轉染，同時設置Con-siRNA組和空白對照組，轉染6 h后更換含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，在37 ℃培養箱中繼續培育，分別在24、48、72、96 h時在每孔細胞中添加10 μL CCK-8試劑，于37 ℃培養箱孵育1 h，用酶標儀檢測450 nm處細胞光密度值(OD值)，實驗重復3次，根據測得的OD值繪制細胞生長曲線。

1.7細胞克隆形成實驗用軟瓊脂將6孔細胞培養板進行鋪板，置培養皿中待用。分別收集轉染24 h后的各組HepG2細胞，胰蛋白酶消化并計數，以液態軟瓊脂重懸細胞，種植于6孔板中，置37 ℃培養箱繼續培養2～3周，待培養皿中出現肉眼可見的克隆時終止培養，用純甲醇固定15 min，加適量的Giemsa染色液染色20 min，洗去染色液后干燥，在低倍顯微鏡下觀察并計數大于10個細胞的克隆數。實驗重復3次。

1.8流式細胞儀檢測細胞周期各組HepG2細胞轉染后24 h，用預冷的PBS洗滌細胞2次，離心后收集1×105～5×105個細胞，用PBS重懸細胞，分別在每組細胞中加入0.5 mL PI/RNase 染色液，輕輕混勻，在室溫下避光反應10 min，隨后上流式細胞儀檢測并分析細胞周期。實驗重復3次。

1.9統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。空白對照組、Con-siRNA組、ERBB2-siRNA組間ERBB2 mRNA和蛋白相對表達量，克隆形成數，細胞周期及PCNA、AKT和p-AKT蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1轉染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細胞中ERBB2表達的影響結果見圖1和表1。可知，與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組HepG2細胞中ERBB2 mRNA和蛋白表達水平均下調；與空白對照組比較，Con-siRNA組HepG2細胞中ERBB2 mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義。

1：空白對照組；2：Con-siRNA組；3：ERBB2-siRNA組

組別ERBB2 mRNAERBB2蛋白空白對照組1.00±0.100.22±0.02Con-siRNA組0.96±0.090.20±0.02ERBB2-siRNA組0.28±0.03*0.03±0.01*F77.558 109.000 P<0.001 <0.001

*：與空白對照組、Con-siRNA組比較，P<0.05

2.2轉染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細胞增殖和克隆形成能力的影響結果見圖2。空白對照組、Con-siRNA組、ERBB2-siRNA組HepG2細胞克隆形成數目分別為(42.66±5.04)、(43.10±4.86)、(15.14±2.16)，3組比較，差異有統計學意義(F=43.008，P<0.001)。與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組細胞增殖受到抑制，且克隆形成數目減少(P<0.05)。

圖2 各組HepG2細胞生長曲線

2.3轉染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細胞周期的影響結果見表2。可知，與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組G0/G1期細胞增多， S期細胞減少。

表2 各組HepG2細胞周期的比較(n=3) %

*：與空白對照組、Con-siRNA組比較，P<0.05

2.4轉染ERBB2siRNA對肝癌HepG2細胞中PCNA、AKT和p-AKT蛋白表達的影響結果見圖3和表3。可知，與空白對照組、Con-siRNA組比較，ERBB2-siRNA組HepG2細胞中PCNA、AKT和p-AKT蛋白表達水平下調。

1：空白對照組；2：Con-siRNA組；3：ERBB2-siRNA組

組別PCNAAKTp-AKT空白對照組0.37±0.041.22±0.130.41±0.05Con-siRNA組0.41±0.041.26±0.110.40±0.04ERBB2-siRNA組0.06±0.01*0.25±0.02*0.05±0.01*F100.091100.13390.071P<0.001<0.001<0.001

*：與空白對照組、Con-siRNA組比較，P<0.05

3 討論

肝癌是臨床上最常見的實體瘤，也是一種發病率和病死率增長較快的惡性腫瘤，是癌癥相關死亡的第三大原因，中國每年約有11萬人死于肝癌。肝癌早期主要通過外科手術治療，然而，肝癌患者中只有不到50%是在早期診斷出來的。晚期肝癌對當前的化學和放射療法具有很強的抵抗性，存活率較低，為40%～50%，預后極差，5 a復發率大于60%。隨著科學技術的發展，基因靶向治療在一定范圍內改善了肝癌患者的存活率。因此探討肝癌發病機制以及尋找新的治療靶點對肝癌的治療具有非常重要的意義。目前研究[16]證實，ERBB2基因在肝硬化患者血液和組織中呈高表達，該基因多態性與肝癌的發生和發展密切相關，提示ERBB2基因可能成為肝癌治療的潛在靶標。本實驗通過RNA干擾技術在肝癌HepG2細胞中轉染ERBB2 siRNA，經qRT-PCR和Western blot檢測轉染效率，結果發現轉染ERBB2 siRNA能夠顯著抑制HepG2細胞ERBB2 mRNA和蛋白表達。分別采用CCK-8法和克隆形成實驗檢測細胞增殖和克隆形成能力，結果顯示，抑制ERBB2基因后細胞增殖能力和克隆形成能力均明顯受到抑制。

PCNA在細胞周期G1晚期大量表達，在S期達到最高峰。PCNA是一種保守的核蛋白，參與調控細胞復制和DNA修復過程。由于PCNA僅存在于處于增殖狀態的細胞核內，因此將其作為評價細胞增殖狀態的指標。目前研究[17]表明，PCNA可作為反映腫瘤細胞增殖狀態的重要指標。本實驗中抑制ERBB2基因的表達后，采用Western blot法檢測PCNA的表達水平，結果顯示肝癌細胞中PCNA蛋白水平顯著下調，提示肝癌細胞增殖受到抑制。此外本實驗采用流式細胞儀檢測細胞周期變化，發現ERBB2基因表達下調后G0/G1期細胞比例增多，S期細胞比例減少，細胞周期阻滯于G0/G1期，這與先前的研究[18-20]結果一致。

PI3K/AKT信號通路廣泛在人類腫瘤中異常表達，AKT被PI3K磷酸化而激活，進而促進腫瘤細胞增殖，調控細胞周期進程，抑制細胞凋亡。研究[21-22]顯示，PI3K/AKT信號通路在肺癌、宮頸癌等多種腫瘤中異常表達，參與調控腫瘤的發生發展。抑制PI3K/AKT信號通路可以通過抑制腫瘤細胞的增殖、誘導細胞凋亡，阻礙腫瘤的進展。本實驗在肝癌細胞中抑制ERBB2基因，經蛋白水平檢測發現，PI3K/AKT信號通路中AKT蛋白磷酸化水平顯著降低，說明下調ERBB2基因的表達能夠抑制PI3K/AKT信號通路的活化，進而抑制肝癌細胞生長，這與Li等[23]研究結果相似。以上實驗結果證明，下調ERBB2基因的表達可通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活抑制肝癌細胞的生長。

總之，本研究結果表明，抑制ERBB2基因可以抑制肝癌細胞生長并阻滯細胞周期進程，相關機制需要進一步研究。