紫檀芪對(duì)2型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬氧化應(yīng)激水平的影響

劉欣欣，孫華磊，葛惠娜，王 騰，李文杰

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

2型糖尿病是常見疾病，臨床表現(xiàn)為多食、多飲、多尿及體重減輕等癥狀，其致病機(jī)制復(fù)雜，與胰島素抵抗有關(guān)[1]。糖尿病認(rèn)知功能障礙，通常指糖尿病本身代謝紊亂及微血管病變所致的大腦功能異常，常無明確的腦血管疾病臨床表現(xiàn)，近似阿爾茨海默病，多為輕度認(rèn)知功能障礙[2]。近年來，2型糖尿病發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，由其引發(fā)的認(rèn)知功能障礙也日益引起研究者[3]的高度重視。因此，深入探討2型糖尿病認(rèn)知功能障礙的防治方法，具有重要的臨床價(jià)值。紫檀芪是一種廣泛存在于天然植物中的二苯乙烯類化合物，具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血糖等[4-7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病嚙齒類動(dòng)物中，紫檀芪具有改善糖代謝異常的作用。有研究[9]結(jié)果顯示，連續(xù)口服紫檀芪6周后血糖水平降低56.54%，血胰島素水平升高；同時(shí)，紫檀芪還可降低糖化血紅蛋白含量，減弱糖異生酶葡萄糖-6-磷酸酶和果糖-1,6-二磷酸酶的表達(dá)，增加糖酵解酶己糖激酶的表達(dá)。此外，在脂肪細(xì)胞中，紫檀芪可以抑制細(xì)胞增殖、脂質(zhì)積聚和三酰甘油的蓄積[10]；它通過下調(diào)瘦素、抵抗素和脂肪酸合成酶以及上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)，來發(fā)揮抑制脂質(zhì)生成的作用。本研究旨在探討紫檀芪對(duì)2型糖尿病的改善作用及其機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑卓越360全自動(dòng)生化分析儀(上海科華生物工程股份有限公司)、Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)、SMG-2水迷宮程序自動(dòng)控制儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、羅氏血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)、鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)、紫檀芪(上海士豐生物有限公司)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、葡萄糖測(cè)定試劑盒和胰島素測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技有限公司)。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組選取4周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠100只，體重170～220 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室溫為18～23 ℃，相對(duì)濕度為45%～55%，通風(fēng)良好，動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，晝夜間隔12 h。

普通飼料由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；高脂高糖飼料：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)59.5%普通粉狀飼料、質(zhì)量分?jǐn)?shù)20.0%蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.0%豬油、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.0%蛋黃粉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%膽酸鈉。

100只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10只作為正常對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。4周后夜間禁食12 h，按40 mg/kg劑量一次性空腹注射鏈脲佐菌素溶液，制備2型糖尿病大鼠模型。正常對(duì)照組大鼠腹腔注射相等體積的枸櫞酸鈉緩沖液。注射鏈脲佐菌素72 h后，尾靜脈采血檢測(cè)大鼠空腹血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L并且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀即為造模成功[11-12]。按上述成模標(biāo)準(zhǔn)篩選出75只大鼠，造模成功率為83.3%。選取造模成功的大鼠40只分為2型糖尿病組、紫檀芪低劑量(20 mg/kg)組、紫檀芪中劑量(40 mg/kg)組、紫檀芪高劑量(80 mg/kg)組，每組10只。紫檀芪干預(yù)組于每日固定時(shí)間按照體重計(jì)算灌胃劑量并灌胃1次。正常對(duì)照組和2型糖尿病組于每日固定時(shí)間給予羧甲基纖維素鈉溶液灌胃1次。連續(xù)干預(yù)7周后，各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，然后腹腔主動(dòng)脈取血測(cè)定血糖和血清胰島素。

1.3大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)干預(yù)7周后，各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[13]，測(cè)定各組的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)，進(jìn)而判斷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮為直徑130 cm、高80 cm的圓形黑色水池，其水深為60 cm，水溫為(22±2) ℃。此水池包括東、西、南、北4個(gè)象限，在第3個(gè)象限正中水下2 cm處設(shè)置直徑為15 cm的圓形平臺(tái)。將大鼠從東、西、南、北4個(gè)象限池的中點(diǎn)放入水中開始計(jì)時(shí)，以大鼠找到平臺(tái)2 s終止記錄，此時(shí)間為逃避潛伏期。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄最后一次逃避潛伏期的訓(xùn)練結(jié)果。最后一次訓(xùn)練結(jié)束后的第2天撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)(所有受試大鼠入水點(diǎn)保持一致)將大鼠面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.4血糖和血清胰島素的測(cè)定水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠夜間禁食、不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛，仰臥位于固定板上，備皮消毒后，打開腹腔，使用真空負(fù)壓管于腹主動(dòng)脈處采取15 mL血液，置于冰上靜置30 min，然后4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血糖和血清胰島素，檢測(cè)方法參照試劑盒說明，空腹血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法，血清胰島素檢測(cè)采用膠乳免疫比濁法。

1.5大鼠海馬組織氧化應(yīng)激水平的測(cè)定血樣采集完畢，斷頭處死大鼠，在冰上剝離腦組織，快速分離海馬。加入PBS中研磨成體積分?jǐn)?shù)10%的海馬組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，采用Bradford法測(cè)定蛋白含量，以黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD 活性，硫代巴比妥酸染色法檢測(cè)MDA，操作步驟參照試劑盒說明。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4組大鼠各檢測(cè)指標(biāo)的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1紫檀芪對(duì)各組大鼠血糖、血清胰島素水平的影響結(jié)果見表1。由表1可知，與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組和中劑量組的血糖降低；同時(shí)，2型糖尿病組的血清胰島素水平高于正常對(duì)照組，紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組的血清胰島素水平均低于2型糖尿病組。

表1 各組大鼠血糖、血清胰島素水平比較

*:與正常對(duì)照組相比，P<0.05；#：與2型糖尿病組相比，P<0.05

2.2紫檀芪對(duì)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響結(jié)果見表2。由表2可知，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，2型糖尿病組大鼠的逃避潛伏期長(zhǎng)于正常對(duì)照組，穿越平臺(tái)次數(shù)少于正常對(duì)照組；紫檀芪干預(yù)7周后，與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加；紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3紫檀芪對(duì)各組大鼠海馬組織SOD活性和MDA水平的影響結(jié)果見表3。由表3可知，與正常對(duì)照組相比，2型糖尿病組大鼠海馬組織的SOD活性降低，MDA水平增高；與2型糖尿病組相比，紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠海馬組織SOD活性升高，MDA水平降低；紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組SOD活性、MDA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較

*:與正常對(duì)照組相比，P<0.05；#：與2型糖尿病組相比，P<0.05

表3 各組大鼠海馬組織氧化應(yīng)激水平的比較

*:與正常對(duì)照組相比，P<0.05；#：與2型糖尿病組相比，P<0.05

3 討論

研究[14-15]顯示，2型糖尿病可以影響患者的認(rèn)知功能，2型糖尿病患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)較非2型糖尿病患者增加1.5倍。目前，對(duì)2型糖尿病認(rèn)知障礙的發(fā)病機(jī)制及原因尚不完全清楚，同時(shí)缺乏有效的防治手段，對(duì)2型糖尿病認(rèn)知功能障礙的探索和防治日益成為備受關(guān)注的問題。

糖尿病所引起的認(rèn)知缺陷主要表現(xiàn)為語言語義記憶、情景記憶、空間記憶能力等受損。本研究中Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，2型糖尿病組大鼠的潛伏逃避期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少；而紫檀芪低劑量組、中劑量組和高劑量組的逃避潛伏期較2型糖尿病組大鼠縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)較2型糖尿病組大鼠增加。結(jié)果說明紫檀芪對(duì)2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有改善作用。有研究[16]結(jié)果顯示，紫檀芪可以通過激活Caspase途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。然而紫檀芪如何改善2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力還需進(jìn)一步探索。

氧化應(yīng)激與2型糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17]。SOD和MDA是反映氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)。SOD在機(jī)體氧化和抗氧化的平衡中發(fā)揮重要作用，它反映清除氧自由基的能力[18]。MDA為機(jī)體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，間接反映細(xì)胞損傷程度[18]。本研究中，與正常對(duì)照組相比，2型糖尿病組大鼠海馬組織的SOD活性降低，MDA水平升高。與2型糖尿病組大鼠相比，3個(gè)紫檀芪干預(yù)組大鼠海馬組織的SOD活性升高，MDA水平降低。結(jié)果提示紫檀芪可能通過發(fā)揮抗氧化作用減少海馬組織的過氧化物的產(chǎn)生，提高SOD活性，改善2型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

目前，對(duì)于2型糖尿病認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚未有統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，對(duì)其治療主要是藥物干預(yù)。本研究結(jié)果顯示，紫檀芪具有改善2型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用，為預(yù)防和治療2型糖尿病認(rèn)知功能障礙提供了一種新思路。