TLR4對肺炎鏈球菌誘導的A549細胞凋亡的影響

李蓮梅，余博文，畢建朋，王曼華

1)青海省婦女兒童醫院感染消化科 西寧 810000 2)西寧市城西區疾病控制中心疾控科 西寧 810000 3)鄭州大學附屬兒童醫院 (河南省兒童醫院；鄭州兒童醫院)泌尿外科 鄭州 450052 4)河南廣播電視大學農醫學院 鄭州 450046

肺炎是5歲以下兒童死亡的重要原因之一[1]。肺炎鏈球菌是兒童社區獲得性肺炎的主要病原。肺泡上皮細胞可以合成和分泌多種活性物質，參與肺炎發生過程。肺泡上皮細胞可以分為Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅱ型肺泡上皮細胞具有維持肺組織正常功能、分泌肺泡表面活性物質等作用，與肺炎發生密切相關[2-3]。Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR4)參與介導細胞凋亡、炎癥、氧化應激等多種病理生理過程，在肺炎引起的肺損傷中發現肺組織中TLR4高表達，TLR4在內毒素、脂多糖等誘導的肺泡上皮細胞損傷中表達上調[3-5]。本實驗以Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的A549細胞作為研究對象，探討TLR4在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡中的作用，以期為明確肺炎肺泡上皮細胞損傷機制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料肺炎鏈球菌R6購自美國ATCC公司，細胞色素C(Cytochrome C)抗體購自碧云天生物技術研究所，胞漿蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購自美國Thermo公司，qRT-PCR試劑盒購自美國Clontech公司，TLR4 siRNA慢病毒和siRNA陰性對照慢病毒、TLR4抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞分組和培養A549細胞分成4組：對照組(不用肺炎鏈球菌誘導刺激)、肺炎鏈球菌組(培養細胞密度為70%時，在細胞中添加1×107CFU/L的肺炎鏈球菌進行誘導刺激)、siRNA-NC組(肺炎鏈球菌誘導刺激A549細胞后，感染siRNA陰性對照慢病毒)和siRNA-TLR4組(肺炎鏈球菌誘導刺激A549細胞后，感染TLR4 siRNA慢病毒)，每組均設5個平行對照。4組細胞繼續培養24 h以后，用qRT-PCR和Western blot檢測沉默效果。

1.3 4組細胞中TLR4mRNA表達水平的qRT-PCR檢測用總RNA提取試劑盒分別提取4組細胞中的總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA作為模板進行PCR擴增。qRT-PCR采用20 μL的反應體系，熒光預變性反應條件為95 ℃ 30 s；PCR反應條件：95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s，45個循環。按照2-ΔΔCt法分析各組細胞中TLR4 mRNA水平。TLR4上游引物序列5’-AGAGCTGAAATG GAGGCACC-3’，下游引物序列5’-AGGACCAGAG GCAGCTCTTG-3’；β-actin上游引物序列5’-TCATT GACCTCAACTACATGGTTT-3’，下游引物序列5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 4組細胞中TLR4、CleavedCaspase-3、細胞胞漿和線粒體中CytochromeC蛋白表達水平的Westernblot檢測4組細胞用冰預冷的PBS洗滌2次后，分別添加細胞裂解液，放在冰上裂解約30 min，收集裂解細胞，轉移到EP管，4 ℃離心后，把上層溶液(蛋白上清液)轉移到EP管中，保存在-70 ℃冰箱。蛋白濃度檢測按照BCA蛋白定量檢測試劑盒。蛋白樣品變性(與Loading Buffer混合煮沸5 min)處理以后，分別添加到凝膠樣品孔內，設置濃縮膠中電壓為60 V，分離膠中電壓為120 V。把凝膠取出，置于轉移緩沖液中孵育15 min，再把PVDF膜置于甲醇溶液中充分浸泡10 min。轉膜置于4 ℃中進行，設置120 mA電流轉膜60 min，用50 g/L牛血清白蛋白常規封閉以后，與TLR4(按1∶200稀釋)、Cleaved Caspase-3(按1∶100稀釋)和Cytochrome C(按1∶200稀釋)一抗置于4 ℃中反應過夜后，再與辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(按1∶4 000稀釋)在室溫條件下孵育結合90 min，ECL法化學發光，Odyssey FC顯影，利用LabWorks 4.5對各蛋白進行定量(內參為β-actin)。

1.5 4組細胞凋亡的流式細胞術檢測4組細胞按照1.2方法處理培養24 h以后，加入冰預冷的PBS重懸，離心后，用結合緩沖液懸浮細胞，添加Annexin V-FITC和PI混合后，置于室溫中孵育15 min。立即用流式細胞儀測定各組細胞凋亡率。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0進行分析，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較4組細胞中TLR4表達水平、細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白、胞漿和線粒體中Cytochrome C表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組細胞中TLR4mRNA和蛋白表達變化見圖1和表1。由圖1和表1可知，TLR4 siRNA慢病毒感染可有效降低肺炎鏈球菌誘導處理的A549細胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達水平。

1：對照組；2：肺炎鏈球菌組；3：siRNA-NC組；4：siRNA-TLR4組

組別TLR4 mRNATLR4蛋白對照組1.00±0.090.21±0.02肺炎鏈球菌組1.89±0.13#0.59±0.06#siRNA-NC組1.87±0.120.57±0.05siRNA-TLR4組0.85±0.07*0.26±0.03*F83.380 65.120 P<0.001 <0.001

#：與對照組比較，P<0.05；*:與siRNA-NC組、肺炎鏈球菌組比較，P<0.05

2.2 4組細胞凋亡和CleavedCaspase-3蛋白表達水平的比較結果見圖2和表2。由表2可知，A549細胞經肺炎鏈球菌誘導處理后，細胞凋亡率和細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均升高，而沉默TLR4表達的A549細胞凋亡率和細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均降低。

1：對照組；2：肺炎鏈球菌組；3：siRNA-NC組；4：siRNA-TLR4組

組別凋亡率/%Cleaved Caspase-3對照組5.69±0.780.20±0.03肺炎鏈球菌組38.26±3.47#0.62±0.05#siRNA-NC組39.52±2.140.60±0.07siRNA-TLR4組24.17±3.82*0.42±0.05*F47.340 42.370 P<0.001 <0.001

#：與對照組比較，P<0.05；*:與siRNA-NC組、肺炎鏈球菌組比較，P<0.05

2.3 4組細胞胞漿和線粒體中CytochromeC蛋白表達水平的比較結果見圖3和表3。由表3可知，A549細胞經肺炎鏈球菌誘導處理后，細胞胞漿中Cytochrome C蛋白表達水平升高，線粒體中Cytochrome C蛋白表達水平降低。沉默TLR4表達的A549細胞胞漿中Cytochrome C蛋白表達水平降低，線粒體中Cytochrome C蛋白表達水平升高。

上：胞漿中Cytochrome C蛋白的表達；下：線粒體中Cytochrome C蛋白的表達；1：對照組；2：肺炎鏈球菌組；3：siRNA-NC組；4：siRNA-TLR4組

圖3 4組細胞胞漿和線粒體中Cytochrome C蛋白的表達

#：與對照組比較，P<0.05；*:與siRNA-NC組、肺炎鏈球菌組比較，P<0.05

3 討論

肺泡上皮細胞存在于肺泡表面，可分為Ⅰ型肺泡上皮細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞，二者存在于同一個基底膜，共同構成肺上皮屏障，能夠維持肺泡相對干燥、清除肺泡過多液體。Ⅱ型肺泡上皮細胞占肺泡細胞的16%，僅覆蓋了肺泡總面積的5%左右，其具有跨膜運輸、分泌活性物質的作用，參與氧化代謝等過程；其既可以增殖產生新的Ⅱ型肺泡上皮細胞，又可以分化成Ⅰ型肺泡上皮細胞。有研究[6-7]表明，肺炎發生與Ⅱ型肺泡上皮細胞過度凋亡有關。肺炎鏈球菌是小兒肺炎發生的重要病原體，其可以誘導肺泡上皮細胞損傷，進而影響肺組織正常功能的發揮[8-9]。本實驗結果表明，肺炎鏈球菌誘導處理后的肺泡上皮細胞A549凋亡增多，提示肺炎鏈球菌可以誘導肺泡上皮細胞凋亡，這與上述報道一致。

TLR4是與天然免疫密切相關的受體，其屬于Toll受體家族。TLR4分子含有胞內區、胞外區和穿膜區，其胞外區含有豐富的亮氨酸，能夠與CD14分子序列結合而影響蛋白質之間的相互作用；胞內區為一段保守的序列，其與白細胞介素1受體的胞內區同源性極高，因此，TLR4又屬于白細胞介素1受體超家族成員[8-10]。有研究[11-14]顯示，TLR4在巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞等各種類型的細胞中存在，在肺臟、胎盤、脾臟等組織中廣泛表達；TLR4參與細胞正常生理功能發揮，并且與腫瘤、肺炎、糖尿病等多種疾病的發生有關。多個研究[5-6,15]表明，TLR4在肺炎大鼠肺組織中高表達；在脂多糖誘導的肺泡上皮細胞損傷中同樣發現TLR4高表達。本實驗表明，肺炎鏈球菌誘導處理后的肺泡上皮細胞中TLR4表達水平升高，沉默TLR4可以明顯抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡，提示沉默TLR4在肺炎肺泡上皮細胞損傷中可能發揮保護作用。

線粒體凋亡途徑是目前發現的與細胞凋亡有關的經典凋亡途徑，其在心肌細胞、肌細胞、皮膚細胞、巨噬細胞等多種細胞中均廣泛存在，線粒體凋亡途徑的關鍵是線粒體中Cytochrome C的釋放，線粒體受到外界因素刺激以后，線粒體膜電位下降，使存在于線粒體中的Cytochrome C進入到胞漿中，而Cytochrome C可以同胞漿中Caspase反應，誘導Caspase級聯反應的發生，最終誘導細胞凋亡發生[16-17]。Caspase-3活化是細胞凋亡發生的標志，也是細胞凋亡進入不可逆階段的標志[18]。本實驗結果顯示，沉默TLR4后肺泡上皮細胞線粒體中Cytochrome C蛋白水平升高，胞漿中Cytochrome C蛋白水平降低，細胞中Cleaved Caspase-3水平降低，提示沉默TLR4可能通過線粒體途徑抑制肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡。

綜上所述，TLR4參與肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡過程，沉默TLR4的表達可減少肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡。本實驗沒有在原代肺泡上皮細胞和體內進行驗證，后續實驗將進行探討。