血型嵌合體一例血清學(xué)特點(diǎn)及基因?qū)W測(cè)序分析

孔存權(quán)，連利霞，朱偉彥，楊子怡，燕備戰(zhàn)

河南省人民醫(yī)院(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院)輸血科 鄭州 450003

嵌合體指其細(xì)胞衍生自兩個(gè)或多個(gè)受精卵的個(gè)體，遺傳學(xué)上指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現(xiàn)的個(gè)體，免疫學(xué)上則指一個(gè)機(jī)體有兩種或兩種以上染色體組成不同的細(xì)胞系彼此耐受不排斥的嵌合狀態(tài)。血型嵌合體是嵌合體的一種，又叫血型開(kāi)米拉，多發(fā)生在異型輸血、異卵雙生或雙精受精以及異型骨髓移植后，其中異型輸血或異型骨髓移植后的血型嵌合屬于暫時(shí)性嵌合，而遺傳性嵌合屬于永久性嵌合(先天性嵌合)。嵌合體尤其是血型嵌合體的存在往往給臨床輸血工作帶來(lái)一些問(wèn)題，諸如血型鑒定困難、輸血困難、親緣關(guān)系疑問(wèn)等。早期，血型嵌合體的檢測(cè)局限于血清學(xué)方法，表現(xiàn)為混合凝集外觀，但很難確診。分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是PCR體外擴(kuò)增和DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為血型嵌合體的研究提供了工具。本研究借助一例嵌合體血型患者，回顧分析了血型嵌合體的血清學(xué)及基因?qū)W特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源該例為河南省人民醫(yī)院門(mén)診患者，年齡、疾病不詳，無(wú)輸血史，無(wú)移植史。

1.2試劑及儀器單克隆抗A、抗A1、抗B、抗AB、抗H抗體及標(biāo)準(zhǔn)反定型紅細(xì)胞A細(xì)胞(Ac)、B細(xì)胞(Bc)和O細(xì)胞(Oc)均購(gòu)于長(zhǎng)春博德公司。DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。血型正反定型卡與抗人球蛋白卡購(gòu)自戴安娜公司。引物合成及測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.3血清學(xué)試驗(yàn)采用試管法與戴安娜血型定型凝膠卡進(jìn)行ABO正反定型，正定型增加抗A1、抗H以及自身對(duì)照，反定型增加Oc。用多特異性抗人球蛋白卡(IgG與C3)檢測(cè)紅細(xì)胞上有無(wú)不完全抗體，用抗篩細(xì)胞檢測(cè)血清中有無(wú)不規(guī)則抗體。采用吸收放散技術(shù)檢測(cè)弱B抗原。

1.4基因?qū)W定型用血液DNA抽提試劑盒抽提先證者及其父親、母親、兒子外周血基因組DNA，分別對(duì)ABO基因的外顯子1～7進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列和擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[1]。PCR體系(25 μL)中包含基因組DNA、引物、混合La酶，反應(yīng)在美國(guó)ABI ProFlex PCR System儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件為95 ℃3 min，95 ℃30 s、57 ℃30 s、72 ℃60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。其中第1外顯子GC含量高，需要GC buffer，各成分加入量及反應(yīng)條件略有變動(dòng)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μL用于瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，獲取目的條帶后，取10 μL進(jìn)行測(cè)序分析。分別對(duì)先證者及其父母ABO 基因的7個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列直接測(cè)序。同時(shí)將先證者血型基因第7外顯子的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司)，在ABI377測(cè)序儀上對(duì)插入片段進(jìn)行序列分析。

1.5交叉配血試驗(yàn)基于疑似嵌合體血型和血清學(xué)結(jié)果，擬用配合性輸注(O型洗滌紅細(xì)胞)，采用凝聚胺結(jié)合卡氏法(Liss-coombs卡)進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1血清學(xué)結(jié)果先證者紅細(xì)胞定型：抗A與抗D凝集強(qiáng)度均為4+、抗B抗血清呈混合凝集(±)且抗B測(cè)定管(或抗人球蛋白卡)底部有大量紅細(xì)胞，未檢出抗A1，反定型Ac、Bc、Oc均不凝集(表1)。家系調(diào)查結(jié)果顯示其父為B型、RhD+，母為A型、RhD+，兒為O型、RhD+，正反定型均一致。先證者B抗體管內(nèi)底層經(jīng)洗滌后的紅細(xì)胞與B抗體血清不凝集，與A抗體凝集，提示是A型紅細(xì)胞，說(shuō)明該患者血里既有A型紅細(xì)胞又有B型紅細(xì)胞。先證者直接抗球蛋白試驗(yàn)陰性，不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)陰性，吸收放散試驗(yàn)證實(shí)存在B抗原。

表1 先證者及家系調(diào)查血清學(xué)結(jié)果

0代表無(wú)凝集，+代表凝集強(qiáng)度，±代表混合凝集

2.2基因檢測(cè)結(jié)果先證者第6、7外顯子區(qū)域顯示存在261G/del、297A/G、467C/T、526C/G、646T/A、657G/T、681G/A、703G/A、771C/T、796C、803G/C、829G/A、930G/C等雜合位點(diǎn)(圖1)，初步判斷可能有3個(gè)等位基因：A102、B101和O02。測(cè)序結(jié)果表明先證者含有A102、B101與O02等3個(gè)等位基因。家系調(diào)查結(jié)果顯示其父基因型為B101O02，母為A102O01，子為O01O02，姐為B101O02。

A，B：雜合位點(diǎn)位于血型基因第6外顯子；C、D、E、F：雜合位點(diǎn)位于血型基因第7外顯子

2.3交叉配血AB型懸浮紅細(xì)胞配血主、次側(cè)均無(wú)溶血、無(wú)凝集。A、B、O型懸浮紅細(xì)胞配血主側(cè)均無(wú)溶血、無(wú)凝集，次側(cè)均無(wú)溶血、有凝集。

3 討論

先證者表現(xiàn)出兩群不同表型的紅細(xì)胞，應(yīng)該屬于遺傳性血型嵌合體。這種在體內(nèi)存在兩種不同遺傳學(xué)特征細(xì)胞群的天然個(gè)體極為罕見(jiàn)，通常在兩個(gè)受精卵合二為一融合時(shí)或胞胎之間血管未分開(kāi)時(shí)已經(jīng)發(fā)生。鑲嵌現(xiàn)象(發(fā)生自單個(gè)配子)和嵌合體(發(fā)生自兩個(gè)或多個(gè)配子)等[2]也屬于這類(lèi)情況。血型嵌合體還會(huì)導(dǎo)致ABO表現(xiàn)型與基因型不相符[3]，如在中國(guó)臺(tái)灣報(bào)道過(guò)1例血清學(xué)表現(xiàn)為AelBel，但其父母基因型卻分別為B101型和A102O02型，通過(guò)單體型基因?qū)W檢測(cè)證實(shí)其為A102O02/B101O02嵌合血型。這里呈現(xiàn)的弱嵌合體血型，推測(cè)原因可能是編碼低活性的A轉(zhuǎn)移酶遺傳或A102O02與B101O02相互影響導(dǎo)致。

自1952年Dunsford等[4]報(bào)道了第一例嵌合體血型現(xiàn)象到目前，全球已發(fā)現(xiàn)了近百例先天性血型嵌合體。血型嵌合體不僅表現(xiàn)在ABO血型系統(tǒng)，其他血型系統(tǒng)如P、Kidd以及Duffy系統(tǒng)中也可存在。目前的研究[5]表明具有嵌合體血型的人，其紅細(xì)胞在做ABO血清學(xué)檢測(cè)時(shí)常呈現(xiàn)混合外觀視野，但常規(guī)的玻片法、試管法等鑒定時(shí)并不容易發(fā)現(xiàn)，具有高靈敏度的微柱凝膠卡法也只能懷疑，嵌合體血型弱抗原也不能通過(guò)吸收釋放試驗(yàn)與抗原減弱區(qū)分開(kāi)來(lái)，確診還需要借助DNA血型分型技術(shù)。嵌合體現(xiàn)象常常會(huì)導(dǎo)致ABO血型遺傳不符合經(jīng)典遺傳規(guī)律[6]。具體到本例先證者，其外表正常，分娩時(shí)并無(wú)雙胞胎、輸血史和干細(xì)胞移植史，其血清學(xué)結(jié)果為AB型，但其紅細(xì)胞凝集不典型(混合視野)，基因定型顯示可能含有A102/B101/O02等位基因。家系調(diào)查結(jié)果顯示其父為B型，基因型為B101O02；母為A型，基因型為A102O01；初步懷疑先證者為嵌合體或者亞型。第6、7外顯子測(cè)序結(jié)果表明先證者具有A102/B101/O02共3個(gè)等位基因，B101和O02可能來(lái)自于其父，而A102來(lái)自于其母。先證者的遺傳因素導(dǎo)致在3個(gè)等位基因存在的情況下，A與B轉(zhuǎn)移酶未能充分發(fā)揮作用，血型鑒定時(shí)呈現(xiàn)混合凝集外觀。先證者未能顯示4個(gè)等位基因可能是在一個(gè)合子中產(chǎn)生的細(xì)胞遺傳學(xué)異常的結(jié)果，例如三體型，額外的染色體來(lái)自一個(gè)親本。

嵌合體血型應(yīng)引起重視。一方面嵌合體血型誤診能引起嚴(yán)重的輸血反應(yīng)[7]。有1例61歲患者因移植術(shù)后高血壓癥、Hct降低，輸入280 mL的O型紅細(xì)胞(與此獻(xiàn)血者為雙胞胎，血液中含少量B抗原)幾小時(shí)后發(fā)生嚴(yán)重溶血。另一方面血型嵌合體免疫耐受的研究對(duì)基因干細(xì)胞移植和骨髓移植有著深遠(yuǎn)的影響。已經(jīng)有越來(lái)越多的研究[8]表明異基因干細(xì)胞移植以及骨髓移植之后形成的微嵌合狀態(tài)，對(duì)受體和移植物均有影響，并且可能有利于宿主對(duì)移植物的免疫耐受，能夠在一定程度上反映移植物的狀態(tài)。目前通過(guò)適當(dāng)方法檢測(cè)受者體內(nèi)嵌合體的分布及數(shù)量變化可用于評(píng)估及預(yù)測(cè)移植后的排斥反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)以及一些自身免疫性疾病。