冷藏鱘魚片優勢腐敗菌的分離與鑒定

李小義 才讓卓瑪 楊星 吳丹 楊明舉

摘要：為確定鱘魚片低溫冷藏過程中優勢腐敗菌，將鱘魚片包裝后在低溫（4±0.5）℃條件下貯藏，12 d后利用選擇性培養基進行腐敗菌的分離篩選。通過生理生化、形態學鑒定及16S rDNA序列分析，對低溫貯藏過程中鱘魚片的優勢腐敗菌進行鑒定。結果表明：鱘魚片在低溫條件下貯藏至12 d時的優勢腐敗菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas， 56.25%）、肉食桿菌屬（Carnobacterium，12.5%）、哈夫尼菌屬（Hafnia，12.5%）、漫游球菌屬（Vagococcus，6.25%）、庫特氏菌屬（Kurthia，6.25%）、普羅維登斯菌屬（Providencia，6.25%）等。

關鍵詞：鱘魚片;冷藏;腐敗微生物;分離;鑒定

由于營養學家們對減少飽和脂肪攝入的提倡，富含多不飽和脂肪酸肉類的消費量大幅增加，然而，多不飽和會加速氧化過程，導致肉的味道、顏色、質地和營養價值的惡化[1]。淡水魚類因其組織結構疏松、蛋白質含量高、脂肪高度不飽和等特點，在加工、運輸及貯藏等過程中受到微生物的污染后，其肉質容易被氧化，引起魚體腐敗變質，貨架期縮短，逐漸失去營養價值和商品價值[2-3]。微生物是引發魚體腐敗變質的主要原因。近年來，人們對導致魚體腐敗的微生物進行了較多的研究。高白鮭魚片冷凍和冰鮮保藏初期腐敗菌主要為假單胞菌，隨著保藏時間延長，腸桿菌逐漸成為優勢腐敗菌[4]。李秀秀等人對鯽魚貯藏過程中優勢腐敗菌研究發現：導致魚肉腐敗的優勢微生物為熒光假單胞菌，與導致魚鰓腐敗的優勢微生物存在差異[5]。

鱘魚為高蛋白、多脂肪性魚類，是世界上優良的淡水魚品種，也是現存于世界上最珍奇、最古老的冷水性生物魚群之一，有“活化石”之稱，其肉厚骨軟，含有人體必需的多種氨基酸，具有很高的經濟價值和藥用價值。目前對鱘魚及鱘魚加工產品腐敗菌群和保鮮技術研究較少，阻礙了鱘魚鮮活及加工產品的市場貿易。本文對冷藏過程中鱘魚片腐敗微生物進行了分離鑒定，旨在提高人們對鱘魚冷藏過程腐敗微生物的認識和為鱘魚片保鮮劑的研究制備提供依據。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用鱘魚采至貴州省水產研究所惠水養殖基地。

1.2主要儀器和試劑

離心機，德國Eppendorf 公司; 電泳儀，北京市六一儀器廠;Gel-Doc2000凝膠成像分析儀，美國BIO-RAD公司;PCR 儀，美國BIO-RAD 公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302），天根生化科技（北京）有限公司;DNA Marker，上海生工生物工程股份有限;革蘭氏染液、微生物生理生化微量鑒定管、鐵瓊脂培養基、MRS培養基、假單胞培養基、Baird-Parker Ager、MYP甘露醇多粘菌素瓊脂培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、察氏瓊脂培養基，青島海博生物技術有限公司; 藥敏試紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3鱘魚片的制備與保藏

從貴州省水產研究所惠水養殖基地采集1500g左右的鮮活鱘魚3條，首先將鱘魚體表粘液清洗干凈，沿腹部剖剪開，去除內臟和魚頭，隨后用清水清洗干凈，去除魚骨，剝去魚皮。對獲得的鱘魚肉用無菌水沖洗數分鐘，洗凈瀝干切片后將鱘魚片置于保鮮盒中，放入冰箱4±0.5℃保藏12d。取腐敗變質的鱘魚片進行腐敗微生物的分離鑒定。

1.4可培養菌株的分離純化

無菌條件下取腐敗變質的鱘魚片10g于50mL無菌離心管內，使用手持式勻質器將鱘魚片制成勻漿狀，隨后在試管內加入20mL無菌水，置于震蕩器上震蕩5min。取1mL 上清液，梯度稀釋至10-8，每個稀釋度做3個重復。分別取200 μL稀釋液于不同的選擇分離培養基內，采用平板涂布法涂板培養。不同培養基分離培養溫度和時間如表1所示。待培養基上菌落生長以后，從平板上挑取典型生長菌落。以LB瓊脂培養基為純化培養基，分離純化3次，獲得單菌落，用于菌種的初步鑒定。

1.5菌株生理生化試驗

參考《常見細菌系統鑒定手冊》[6]對分離純化獲得的單菌進行生理生化鑒定。

1.6單菌16S rRNA基因分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒對分離獲得的單菌DNA進行抽提，操作方法參考試劑盒說明書。

16S rRNA基因測序及系統發育分析：16S rRNA基因正向擴增引物： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（ 位于E.coli 16S rRNA基因的第8～27個堿基位置） ; 反向擴增引物：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'（ 位于E.coli 16S rRNA基因的第1512～1493個堿基位置）[7]。PCR擴增條件：95℃預變性5min;接著94℃變性1min，55℃復性1min，72℃延伸1.5min，32 個循環;最后72℃溫育10min。 擴增產物經1%瓊脂糖（ 質量占比） 凝膠電泳確定條帶后直接交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

2結果與分析

2.1可培養優勢菌的分離純化

從不同成分的選擇培養基上挑取優勢菌株進行純化，剔除重復共獲得16株單菌。以下實驗均以這16株菌為材料。

2.2單菌生理生化鑒定

16株單菌的生理生化檢測結果如表2所示。結果表明，16株菌株均不能利用葡萄糖進行產氣，不能產硫化氫，同時也不能利用側金盞花醇。

2.316S rDNA基因分析

對分離的菌株進行16S rDNA基因擴增、測序和Blastn比對分析，16株單菌的16S rDNA序列相似性與模式菌株序列相似性在99.75%～100%之間。16株單菌的系統進化分析結果如圖1所示。分離的16株單菌主要分布在γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和芽胞桿菌綱（Bacilli），分別占比75%和25%，分屬于假單胞菌屬（Pseudomonas， 56.25%）、肉食桿菌屬（Carnobacterium，12.5%）、哈夫尼菌屬（Hafnia，12.5%）、漫游球菌屬（Vagococcus，6.25%）、庫特氏菌屬（Kurthia，6.25%）、普羅維登斯菌屬（Providencia，6.25%）等6個屬。16株菌的16S rDNA系統進化樹如圖1所示。

3討論

魚體種類、來源及貯藏方式不同，優勢腐敗菌組成復雜且變化大。冬、春時期中冷藏鯧魚貯藏期間優勢腐敗菌的種類基本一致，以革蘭氏陰性菌為主，主要腐敗菌為嗜冷桿菌、草莓假單胞菌、熒光假單胞菌、熱殺索絲菌及腐敗希瓦氏菌等[8]。在鱸魚-2℃微凍和4℃冷藏情況下H2S菌和假單胞菌增長快，主要優勢腐敗菌為腐敗希瓦氏菌和假單胞菌。鯧魚在氣調包裝冷藏期間，腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌與嗜冷桿菌為主要優勢菌[9]。添加0.2%山梨酸和苯甲酸等改變水產品pH值對酵母、霉菌和許多真菌具有抑制作用，但可使乳酸菌變為優勢菌[10]。真空包裝冷藏條件下，鱘魚的優勢腐敗菌為氣單胞菌和腸科菌[11]。蘿卜籽蛋白提取物處理鱘魚片后，托盤包裝貯藏可有效減少腐敗微生物的生長[12]。

唐文靜等人對海鱸魚冷藏期間的腐敗菌進行分離鑒定，獲得4株優勢腐敗菌，其中草莓假單胞菌具有較強的致腐能力[13]。劉愛芳等人研究了假單胞菌、不動桿菌及熱死環絲菌對金槍魚的致腐能力，結果表明假單胞菌致腐能力較強[14]。庫特氏菌最初從雞腸道分離獲得，未有研究顯示該菌屬與肉類的腐敗變質直接相關，但卻是豆腐腐敗的特定腐敗菌[15-16]。乳酸菌廣泛存在于自然界，且物種多樣性豐富，其多個屬被鑒定為引起食品腐敗變質的優勢腐敗菌，肉食桿菌屬是水產品中常見的乳酸菌[17]。肉食桿菌屬[JP]（Carnobacterium maltaromaticum）為小黃魚在真空和氣調包裝冷藏條件下的優勢腐敗菌[18]。蜂房哈夫尼菌易引起真空包裝的肉制品腐敗變質[19]。本研究通過對低溫冷藏12d的鱘魚片腐敗微生物進行分離鑒定，共獲得16株單菌，主要分布在假單胞菌屬、庫特氏菌屬、肉食桿菌屬、哈夫尼菌屬、普羅維登斯菌屬及漫游球菌屬等。其中，假單胞菌為主要優勢菌屬。本文分離獲得的菌屬對鱘魚片的致腐能力還有待進一步研究。

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