Met基因在黏蟲生殖中的功能分析

劉娟娟 李平 江幸福 程云霞 張蕾

摘要 ：保幼激素（juvenile hormone， JH）是由咽側體分泌的倍半萜類化合物，可以調控昆蟲的很多生理過程，如發育、變態、生殖等。作為bHLH?PAS（helix?loop?helix?Per?ARNT?Sim）轉錄因子家族成員之一的methoprene?tolerant （Met）是JH的受體，在JH的信號傳導過程中有非常重要的作用。本研究通過實時熒光定量PCR結合RNAi技術測定了沉默Met基因后黏蟲Mythimna separata的Vg基因表達、卵巢發育和生殖行為，旨在探究Met基因在黏蟲生殖過程中的功能。結果表明當Met基因沉默后，與卵巢發育密切相關的卵黃原蛋白（vitellogenin， Vg）基因表達量下調了50%，從而顯著抑制了卵巢發育，并導致產卵顯著延遲、產卵歷期顯著縮短，產卵量顯著下降。結果表明Met基因是黏蟲生殖發育過程中的關鍵受體基因，它通過調節后續Vg的表達和沉積，來達到控制卵巢發育，從而調控生殖作用。

關鍵詞 ：黏蟲;?保幼激素;?Met;?卵黃原蛋白;?生殖

中圖分類號：

Q965

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2019113

Function of methoprene?tolerant genes in the reproduction of Mythimna separata

LIU Juanjuan1，?LI Ping2，?JIANG Xingfu1，?CHENG Yunxia1，?ZHANG Lei1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing?100193， China; 2. Nanjing Agricultural University， Nanjing?210095， China）

Abstract

Juvenile hormone （JH） is a sesquiterpene compound secreted by the corpus allatum and can regulate many physiological processes of insects， such as development， metamorphosis， reproduction， etc. Methoprene?tolerant （Met）， belonging to the family of the basic helix?loop?helix?Per?ARNT?Sim （bHLH?PAS）transcription factors， is most likely the receptor of juvenile hormone （JH） and plays a crucial role in JH signaling pathway. In this study， we used qPCR combined with RNAi to determine the expression of Vg gene， ovarian development and reproductive behavior in M.separata after silencing Met gene， aiming to explore the functions of Met in the reproduction of M.separata. The results showed that， when Met gene was silenced， the expression of Vg gene， which is closely related to ovarian development， was down?regulated by 50%， leading to the significant inhibition of ovarian development， the delay of oviposition and the decrease of oviposition period and egg production. The results indicated that the Met gene is a key receptor gene in the process of reproductive development of M.separata. It regulates the expression and deposition of Vg to control ovarian development and regulate reproduction in M.separata.

Key words

Mythimna separata;?juvenile hormone;?methoprene?tolerant;?vitellogenin;?reproduction

生殖是昆蟲在生態系統中維持種群繁衍的基本特性[1]。保幼激素（juvenile hormone， JH）是由昆蟲的咽側體分泌的倍半萜類化合物，參與調控昆蟲生長、發育、變態、滯育和繁殖等多個過程。在雌性成蟲中JH通過控制卵黃原蛋白的合成和攝取來調控昆蟲的生殖行為[2]。研究發現棉鈴象甲Anthonomus grandis、德國小蠊Blattella germanica、赤擬谷盜Tribolium castaneum咽側體分泌的JH通常誘導卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）在脂肪體中合成，分泌到血淋巴中，進而被卵母細胞吸收[35]。此外，對蟑螂和蝗蟲外源點滴保幼激素類似物后，可以誘導卵黃原蛋白在脂肪體內大量合成[69]。

研究表明，JH需要通過受體才能發揮作用。前期對許多昆蟲的JH信號傳導的分子機制研究表明作為bHLH?PAS轉錄因子家族成員之一的Met（methoprene?tolerant）最有可能為JH的受體。RNAi干擾赤擬谷盜Met基因后，出現了早熟蛹[10]。Met與JH共同調節著昆蟲的生殖、卵巢的發育和Vg的合成。雙翅目果蠅Met突變體[1112]以及RNAi干擾Met基因后的埃及伊蚊[1314]都表現出卵巢發育遲緩和生殖力下降。在太平洋碩蠊Diploptera punctata和臭蟲Cimex lectularius中，Met基因被沉默后顯著降低了Vg信使RNA （mRNA）的表達[1516]。在直翅目東亞飛蝗 Locusta migratoria中已經證實JH通過Met基因控制卵黃發生和卵母細胞成熟[17]。

黏蟲Mythimna separata是一種典型遠距離遷飛害蟲，寄主植物達100多種，是嚴重威脅我國玉米、小麥和水稻三大主糧生產的重大害蟲。新中國成立后黏蟲多次暴發成災并造成了巨大經濟損失，嚴重威脅我國農業經濟的發展[18]。前期研究發現，JH調控貫穿在黏蟲遷飛和生殖的過程中。黏蟲在性成熟前開始遷飛，經過長距離遷飛后遷入種群的JH和卵巢發育級別均高于遷出種群[1920]。羽化后1日齡飛行顯著提升咽側體（corpus allatum，CA）的活性，加速飛行肌降解[21]。1日齡點滴JH類似物（juvenile hormone analogue， JHA）使產卵提前，飛行能力下降;1日齡是JH作用的關鍵時期[22]。此外，羽化后1日齡黏蟲Met基因的表達量顯著高于其他日齡，且黏蟲飛行2個夜晚后卵巢內Met表達量顯著提高[23]。因此明確JH在黏蟲生殖過程中的信號傳導途徑，可以提高黏蟲的預測預報和防控水平。在本研究中，利用RNA干擾技術，抑制Met基因的表達，從而明確了Met在黏蟲生殖過程中的功能。

1?材料方法

1.1?試驗材料

供試昆蟲：野外采集黏蟲成蟲在實驗室繁殖1、2代后的成蟲供試。幼蟲采用約40 cm高的玉米葉飼養，飼養密度為10頭/瓶，溫度為24℃，光周期為L∥D=14 h∥10 h，相對濕度為70%左右[24]。

主要儀器和試劑：熒光定量7500 Real?time PCR（ABI公司，美國）;微量注射儀（WPI公司，美國）。TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）;反轉錄試劑盒FastQuant RT Kit（with gDNase）（天根生物科技有限公司，北京）;實時熒光定量試劑盒SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）（天根生物科技有限公司，北京）;普通引物合成（生工生物工程股份有限公司，上海）;Taq Master Mix（Dye Plus）（諾唯贊生物科技有限公司，南京）;基因干擾引物（銳博生物科技有限公司，廣州）。

1.2?試驗方法

RNAi引物設計與合成：利用NCBI及黏蟲轉錄組數據庫查找出Met基因（登錄號：MH050927.1）序列，由銳博生物有限公司（廣州）公司設計并合成3條Met基因的siRNA片段及1條與黏蟲任何基因的轉錄本都不同源的陰性對照（NC）siRNA片段（表1）。

RNAi引物篩選：注射日齡為初羽化1日齡，注射濃度為0.1 nmol/μL，體積為2 μL，注射部位為雌蛾腹部第5～6節間膜，取樣時間為注射后24、48、72 h。共設置5組處理，每組處理設置3個重復。其中以注射相同體積的無RNA酶水為空白對照，以NC為陰性對照0.1 nmol/μL，以siRNA?1、siRNA?2、siRNA?3為Met基因RNA干擾處理組。注射后解剖卵巢取樣，采用實時熒光定量PCR方法檢測對Met基因的干擾效果，沉默效率=（1-基因沉默后組織中Met基因的表達量/清水對照組織中Met基因的表達量）×100%。篩選出沉默效率最高的siRNA片段及注射后時間。

Met基因的功能驗證：根據以上引物篩選結果，選取抑制效果最佳的Met基因的siRNA片段，選擇初羽化1日齡雌蛾進行注射，以注射siRNA的黏蟲為處理，注射濃度為0.1 nmol/μL，體積為2 μL;以注射相同濃度和體積NC的黏蟲作為陰性對照;以注射相同體積的無RNA酶水作為對照;采用實時熒光定量PCR方法測定RNA干擾48 h后Vg基因的相對表達量，研究Met基因表達被抑制后卵巢發育情況;此外，注射后立即與雄蛾一比一配對，每日飼喂5%新鮮蜂蜜水直至成蟲死亡，記錄產卵前期、總產卵量、產卵歷期、交配次數等參數。

1.2.1?總RNA的提取及cDNA的合成

取處理后雌蛾的卵巢3對放入無RNA酶離心管中，利用TRIzol方法提取總RNA。用無RNA酶水溶解后，用NanoDrop分光光度計測定核酸濃度以及OD260/OD280。參照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）合成cDNA。

1.2.2?實時熒光定量PCR反應

從黏蟲轉錄組數據庫及NCBI GenBank數據庫獲得黏蟲Vg基因（登錄號：KF501044.1）和Met基因序列，由上海生物工程股份有限公司設計并篩選出比較合理的引物Met?qF/Met?qR、Vg?qF/Vg?qR，用于qPCR試驗。內參基因選擇黏蟲β?actin基因[2526]（登錄號：GQ856238.1）。

本試驗采用的方法是SYBR Green法。每個處理有3個生物學重復及3個技術重復。熒光定量PCR反應程序為：95℃預變性15 min后進行40個循環，循環條件包括95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸32 s;Met基因的反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.6 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加RNAase?free ddH2O補齊至20 μL。Vg基因的反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA模板2 μL，加RNAase?free ddH2O補齊至20 μL。

1.2.3?數據處理與分析

使用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。試驗得到的參數均由均值±標準誤表示。通過2-△△Ct法對黏蟲Met和Vg基因定量測定數據中的Ct值進行處理分析。所有數據均采用單因素方差分析（one?way ANOVA），平均數多重比較使用Tukeys HSD法，差異顯著性檢驗水平為P<0.05。

2?結果與分析

2.1?siRNA片段的篩選

從Met基因熒光定量的結果（圖1）可以看出：3個處理時間的結果中陰性對照與清水對照沒有顯著性的差異;注射后24 h，siRNA?1、siRNA?2、siRNA?3 3條片段均無顯著的沉默效果（F4，40=3.719， P=0063），片段siRNA?2沉默效率最高，為64%;注射后48 h，片段siRNA?2有顯著的沉默效果（F4，40=6.257， P<0.05），其中片段siRNA?2的沉默效率可達80%以上;注射后72 h，片段siRNA?2仍有顯著的沉默效果但沉默效率下降（F4，40=12.253， P<0.05），其中片段siRNA?2的沉默效率降為58%。因此，片段siRNA?2對Met基因的沉默效率最高，并且處理后48 h沉默效果最佳。

2.2?Met基因干擾后對Vg基因表達量以及卵巢發育的影響

通過以上siRNA片段的篩選結果，采用片段siRNA?2干擾Met基因48 h后，Vg基因的表達量顯著下調（F2，6=15.402， P=0.004），與清水對照相比下調了約50%;陰性對照與清水對照相比Vg基因的表達量沒有顯著性變化（圖2）。從圖3可以看出，干擾Met基因后，卵巢的發育級別與對照相比顯著降低（F2，57=10.091， P<0.05）。從圖4可以看出，Met基因被干擾48 h后，卵巢的發育顯著減緩，卵巢管透明，卵粒還未形成，卵黃尚未沉積，卵巢的發育級別多數為1級;清水對照卵巢的發育級別多數為2級，卵巢管為白色，卵巢管中已形成卵粒。

2.3?Met基因干擾對黏蟲生殖和壽命的影響

如圖5所示，黏蟲成蟲的Met基因被沉默后，對黏蟲的產卵前期有顯著影響（F2，57=4.756， P<005）， 產卵前期與對照相比延長了0.61 d，且差異顯著;陰性對照與清水對照相比沒有顯著性差異。從表3可以看出，干擾成蟲的Met基因后，對交配次數（F2，57=1.307， P=0.261）、雌蟲壽命（F2，57=2.355， P=0103）均無顯著影響;但與清水對照相比，產卵量（F2，57=7.467， P<0.05）顯著下降，產卵歷期（F2，57=5.880， P<0.05）顯著縮短（縮短了0.78 d），交配率下降了27百分點。

3?討論

在本研究中發現，干擾黏蟲的Met基因48 h后，Vg基因的表達量顯著下調。有研究顯示，鞘翅目赤擬谷盜Met基因被干擾后卵子發生受阻以及Vg的轉錄水平下調[5]，與本研究結果相符。此外，干擾雌性成蟲的Met基因后，顯著抑制了黏蟲卵巢的發育和生殖。這與大猿葉蟲Colaphellus bowringi Baly和褐飛虱Nilaparvata lugens Stl的相關研究相符， 沉默大猿葉蟲和褐飛虱的Met基因后都表現出卵巢發育遲緩，且褐飛虱的產卵前期顯著延長，產卵量顯著下降[2728]。黏蟲Met基因表達被抑制后，JH不能與受體結合，JH下游的信號傳導受阻，抑制了Vg基因的表達，從而影響雌性個體的生殖和卵巢的發育。保幼激素（JH）的主要功能是促進Vg在雌性成蟲脂肪體中的合成，Vg分泌到血淋巴中，被卵母細胞吸收，從而促進卵巢的發育和成熟。正常的卵細胞生長依賴于卵母細胞大量攝取Vg。因此，根據結果推斷，在干擾黏蟲的Met基因后，JH的信號傳導通路受阻，Vg基因的轉錄受阻，表達量下降。卵母細胞由于不能攝取足夠的Vg，其發育和成熟受阻，從而抑制了卵巢的發育以及生殖。對飛蝗的研究發現，RNAi抑制Met基因表達后，不僅阻止了JH誘導Vg的表達、阻斷了卵巢發育和脂質沉積，而且影響卵泡上皮細胞的大小以及降低了卵泡細胞的通暢性（卵泡開放），而卵泡細胞之間的細胞間空隙是將Vg轉移到卵母細胞所必需的通道[17]。此外，JH會影響DNA復制，RNAi抑制Met表達后，降低了飛蝗脂肪體細胞的倍數性和DNA含量進而影響卵黃的形成和卵母細胞的成熟[2930]。

干擾大猿葉蟲Met基因后注射JHA，發現Vg1和Vg2相對表達均顯著下降[26]。在黏蟲的前期研究中發現羽化后1日齡點滴保幼激素類似物后，可以縮短產卵前期，卵巢的發育進度顯著加快[23]。因此，為進一步明確Met為JHA的受體，需要對Met基因干擾48 h后的初羽化黏蟲點滴JHA，測定對Vg基因表達量、卵巢發育以及產卵前期、產卵歷期的影響。通過點滴JHA的試驗結果進一步表明黏蟲JH通過受體Met基因促進Vg基因的表達和卵巢的發育，從而進一步證實Met在黏蟲生殖過程中的重要作用。通過一系列的結果中推斷出JH的受體Met基因在黏蟲生殖過程中對于JH的信號傳導以及功能的發揮有至關重要的作用。然而，黏蟲Met下游對卵黃生成作用以及卵母細胞成熟的分子調控機制仍不清楚。前期研究發現C2H2型鋅指轉錄因子Kr?h1 （Kruppel?homolog 1）是Met的直接靶標基因[31]。沉默蟑螂的Met基因后不僅使Met mRNA表達量顯著下調，也使它下游的靶基因Kr?h1的轉錄水平顯著降低[16]。沉默赤擬谷盜Kr?h1基因后出現了早熟蛹，這與Met基因和合成JH的甲基轉移酶（JHAMT）下調的結果相似[3233]。因此，為了完善黏蟲JH下游卵黃發生和卵母細胞成熟的分子調控機制，需要進一步研究Kr?h1在黏蟲生殖過程中的功能。

本研究發現干擾Met基因的表達后，阻礙了卵巢的發育和Vg基因的表達，抑制了生殖。因此，本研究結果表明JH通過與受體Met結合調控Vg的轉錄和卵巢的發育，進而影響生殖。本研究證明了Met在黏蟲生殖中過程中的重要作用，對從生理和分子層面解析黏蟲遷飛致災的調控機理、提高預測預報和防控水平具有重要意義。

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（責任編輯：田?喆）