紫外線誘變萊氏綠僵菌對敵敵畏的耐藥性

王詩瑋 紀琪 朱天輝

摘要 ：為篩選出對常用有機磷殺蟲劑敵敵畏具有較強耐藥性的萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi突變菌株，本文通過紫外線照射誘變萊氏綠僵菌，并利用敵敵畏對紫外突變菌株進行4次藥劑理化誘變，并對突變株進行了抗性水平、遺傳穩定性測定，得出敵敵畏對萊氏綠僵菌孢子的致死濃度為1 291 mg/L，適合萊氏綠僵菌紫外線誘變的最佳照射時間為2 min和2.5 min，得到6株能耐1 291 mg/L敵敵畏的突變菌株，其中突變株Nr?UVY6的抗性水平是出發菌株的2.57倍，抗藥性遺傳穩定性也最佳。

關鍵詞 ：紫外線誘變;?萊氏綠僵菌;?敵敵畏;?藥劑理化誘變;?耐藥性

中圖分類號：

S 476.11

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018465

Resistance of Metarhizium rileyi UV mutation to dichlorvos

WANG Shiwei，?JI Qi，?ZHU Tianhui

（College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Wenjiang?611130， China）

Abstract

In order to screen out the mutant strain of Metarhizium rileyi which is highly resistant to dichlorvos， a common organophosphate insecticide. The M. rileyi strain mutagenized by ultraviolet irradiation， and DDVP was used to domesticate the mutant strain for 4 times. The resistance level and genetic stability of the mutant were determined. The lethal concentration of dichlorvos against the spores of M.rileyi was 1 291 mg/L， and the optimal durations fort UV irradiation were 2 min and 2.5 min. Six mutant strains resistant to 1 291 mg/L DDVP were obtained. The resistance level of the mutant strain Nr?UVY6 was 2.57 times higher than the original strain， and the genetic stability of the drug resistance was also the best.

Key words

UV mutagenesis;?Metarhizium rileyi;?dichlorvos;?drug mutagenesis;?drug resistance

萊氏野村菌Metarhizium rileyi現已更名為萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi，是一種重要的昆蟲病原真菌。據不完全統計，其對40多種鱗翅目昆蟲具有致病性，尤其對夜蛾科害蟲具有較強的致病性。在各類昆蟲病原物（包括細菌、病毒和線蟲等）中，真菌是唯一能通過表皮侵入昆蟲的病原微生物，其在害蟲生物防控中具有重要作用[1]。通常使用的方法是以孢子懸浮液的形式噴施到農作物或者林木上或以土壤緩釋的方式來感染靶標害蟲。周立峰等發現萊氏綠僵菌Nr15菌株對斜紋夜蛾的田間侵染率超過90%，有著巨大的應用潛力[2]。此外，它對人體和其他非靶標生物包括昆蟲、寄生蟲和天敵無毒，不僅具有較高的實用價值而且在環境中能自然降解，是一種高效、環保的實用生防菌。

但在實際應用中，多種殺蟲劑都對萊氏綠僵菌菌絲的生長或孢子的形成具有一定的抑制作用[3]。邱思鑫等[4]對使用20種常用殺蟲劑對萊氏綠僵菌孢子萌發和菌絲生長造成的影響進行了測定，結果表明，60%的殺蟲劑對孢子萌發抑制率達50%以上，說明大多數殺蟲劑對萊氏綠僵菌孢子的形成有一定的抑制作用，其中敵敵畏的抑制率高達8868%。試驗結果同時表明各殺蟲劑對萊氏綠僵菌的菌絲生長有不同程度的抑制作用，其中有機磷類的5種殺蟲劑抑制率均較高。綜合治理可以兼具化學農藥和蟲生真菌雙方的優點，要使微生物殺蟲劑在存在殺蟲劑的速效性時兼具萊氏綠僵菌的持效性，從而在控制病蟲害的前提下大幅度減少化學殺蟲劑的施用量，進而獲取經濟和環境效益的雙贏，最有效的措施就是對萊氏綠僵菌進行誘變。

采用人工誘變和基因工程手段可以獲得抗藥性生防菌株，但目前基因工程改造生防菌的技術還不是很成熟，操作技術難度較大，只有少數種類獲得成功[5]。物理誘變中的紫外線誘變因其作用時間長、效果好、突變隨機性強，可在短時間內獲得大量突變體等優勢，在誘變育種工作中得到大量運用[67]。由于復合誘變效果優于單因子誘變，因此，本試驗主要采用紫外線誘變和含敵敵畏培養基理化誘變相結合的方法，以不同濃度敵敵畏對突變株及繼代培養菌株的生長影響來對突變株的抗藥性水平進行初步評價。

1?材料和方法

1.1?試驗材料

1.1.1?出發菌株

萊氏綠僵菌出發菌株由四川農業大學森林保護學科實驗室提供。

1.1.2?試劑

蛋白胨，杭州微生物試劑有限公司;無水葡萄糖，西隴科學股份有限公司;瓊脂，上海伊卡生物技術有限公司;吐溫80，成都市科龍化工試劑廠;77.5%敵敵畏乳油，漯河科瑞達生物科技有限公司;無水乙醇，成都市科隆化學品有限公司;甘油，四川西隴化工有限公司;酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.3?培養基

PDA培養基[8]、PPDA培養基[9]、SMAY培養基[9]，均為自然pH。

1.2?試驗方法

1.2.1?原始菌株擴繁

將萊氏綠僵菌原始菌株轉接到PPDA斜面培養基上進行擴繁，在溫度27℃、相對濕度95%、光照條件L∥D=12 h∥12 h的恒溫光照培養箱中培養7～15 d，于冰箱4℃保存備用。

1.2.2?制備孢子懸浮液

將試管保存的萊氏綠僵菌菌株接種在 PDA培養基上，收集孢子，用無菌的0.05%（V/V）吐溫80水溶液反復沖洗孢子，倒入無菌三角瓶，經27℃恒溫磁力攪拌器攪拌60 min使孢子分散活化，用脫脂棉或者無菌濾紙過濾掉菌絲和雜質，得到較純的孢子懸浮液，再稀釋成約102～103個/mL孢子懸浮液。

1.2.3?敵敵畏對萊氏綠僵菌孢子致死濃度的測定

將77.5%的敵敵畏乳油稀釋10倍后再稀釋1 600、1 200、800、600、400倍（稀釋后濃度為484、646、968、1 291、1 937 mg/L）分別加入到培養基中，并制成不同濃度的含藥平板，每個濃度設3個重復。吸取0.1 mL萊氏綠僵菌孢子懸浮液均勻涂布于含藥平板上，以不加敵敵畏的PDA平板為對照，置于27℃恒溫培養箱中，培養3～5 d后逐日觀察菌落生長情況。在前一個較低濃度平板上長出菌落而在后一個較高濃度平板上未長出菌落，后一濃度即為敵敵畏對萊氏綠僵菌出發菌株孢子的致死濃度。

1.2.4?紫外線誘變最佳照射時間的確定

吸取0.1 mL孢子懸浮液均勻涂布于PDA平板上，然后打開皿蓋置于已預熱30 min的16 W暗箱三用紫外分析儀內進行紫外線照射，照射距離為16 cm，波長254 nm。誘變時間從0.5～20 min分次分梯度設置，以不經紫外線照射的孢子懸浮液涂布培養平板為對照，所有處理均設3個重復。試驗操作全程避光。48 h后視生長情況逐日統計菌落數并計算紫外誘變后的致死率，并以致死率在70%～80%確定最佳的紫外線照射時間。致死率按下式計算：

致死率=

未經誘變處理組菌落數-誘變處理組菌落數未經誘變處理組菌落數×100%。

1.2.5?紫外線多次重復誘變

以試驗所得的最佳紫外線照射時間為誘變時間進行多次循環誘變，每次以前一次誘變后產生的菌落直徑大于出發菌株且產孢快、孢子豐富、無污染的突變株為材料做成孢子懸浮液，同樣涂抹于平板上進行紫外線照射得到下一代突變株，如此重復，直到突變株的菌落直徑與上一代突變株相比無明顯增加時即結束誘變。對最終誘變所得的突變株進行編號、保存。

1.2.6?抗敵敵畏突變株的篩選

將經過紫外誘變后得到的突變株產生的孢子制成孢子懸浮液。以77.5%敵敵畏乳油有效成分濃度968 mg/L作為初始藥劑理化誘變濃度進行紫外線誘變加藥劑理化誘變，吸取0.1 mL孢子懸浮液涂布于含敵敵畏968 mg/L的培養基平板上，16 W紫外燈下誘變2.5 min，每處理重復3次，避光培養5～7 d，期間逐日觀察記載菌落生長情況。凡是在平板上長出菌落的，即為抗敵敵畏968 mg/L的突變菌株。挑取菌落直徑大、孢子豐富、產孢快的單菌落繼續進行紫外線誘變和更高濃度的含藥培養基理化誘變，通過多次理化誘變，逐步提高藥劑濃度直到在含敵敵畏3 875 mg/L的培養基上長出菌株。選擇菌落直徑大、產孢快、孢子豐富的單菌落保存。

1.2.7?突變株對敵敵畏的抗性水平測定

采用菌絲生長抑制率法[1011]測定萊氏綠僵菌突變株對敵敵畏的抗性水平。將原出發菌株和突變株Nr?UVY1、Nr?UVY6培養10 d后，移接到含敵敵畏1 600、1 200、800、600、400、300、200倍稀釋液（濃度分別為484、646、968、1 291、1 937、2 583、3 875 mg/L）的PDA平板中央，以不加敵敵畏為對照，每個處理設3個重復，置于溫度27℃、相對濕度在95%、光照條件L∥D=12 h∥12 h的恒溫光照培養箱中培養，每個處理重復3次。10 d后，待萊氏綠僵菌生長穩定后，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，并計算出各菌株的抑制率值、EC50以及抗性水平。

抑制率=（對照菌落數-處理菌落數）/對照菌落數×100%;

抗性水平： 抗性比=突變株EC50/出發菌株EC50。

1.2.8?突變菌株的遺傳穩定性測定

將經紫外線誘變和含藥培養基理化誘變后獲得的高抗性突變株制成孢子懸浮液，分別接種于含敵敵畏濃度為突變菌株最高耐藥濃度的含藥培養基和空白培養基上，27℃恒溫培養，連續轉接7代，每隔8 d轉接1次。觀察菌株在含藥培養基上的生長狀況，并用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復3次，計算敵敵畏對各代突變株的生長抑制率并繪制各突變株相對應的遺傳穩定性圖表。

2?結果與分析

2.1?敵敵畏對萊氏綠僵菌孢子的致死濃度

對照組接種2 d后即有菌落產生，隨后綠色分生孢子很快布滿平板并覆蓋了菌絲;在敵敵畏濃度為484、646 mg/L的含藥平板上第3天開始有菌落產生，隨后綠色分生孢子逐漸產生;在濃度為968、1 291 mg/L的含藥平板上第5天才見有菌落長出，7 d后才見產孢，和前幾組處理相比，這兩種濃度處理下的菌落更小、孢子更少，且在含敵敵畏1 291 mg/L處理中分生孢子產量銳減，到第10天也只有幾個小菌落，而在敵敵畏濃度1 937 mg/L的含藥平板上第10天也未見有菌落產生，由此表明，濃度1 291 mg/L為敵敵畏對萊氏綠僵菌出發菌株孢子的致死濃度，并以此為抗藥性致死突變標志。

2.2?紫外線誘變

2.2.1?紫外線照射時間的確定

由表1可知，萊氏綠僵菌孢子經紫外線照射10 min時死亡率已達92.47%，紫外線照射15 min 和20 min 后，萊氏綠僵菌的死亡率均為95.21%，說明15 min以后的照射最多影響長勢，對存活尚無明顯影響。當紫外線波長、功率、照射距離等條件一定時，致死率隨照射時間（即紫外線照射劑量）的增加而增加，且在0～5 min這一時間段內的死亡率增加最快，照射5 min時萊氏綠僵菌的死亡率已接近90%。由于5～20 min照射的致死率均不在70%～80%之間，故重新進行第2次紫外線誘變，結果見表2。

表2同樣顯示隨著紫外線照射時間的增加，萊氏綠僵菌的死亡率也增加，當照射0.5 min時，死亡率僅63.01%，而照射3 min時，致死率已達82.88%。經計算，在0～0.5 min這一時間段內，萊氏綠僵菌的死亡率增加最快，0.5 min之后死亡率上升趨勢較平穩，到3 min時死亡率已超過80%。根據要求需要選擇致死率在70%～80%之間的，故2 min和2.5 min均為適合萊氏綠僵菌的紫外照射時間。為統一標準，后續試驗均采用紫外線照射2.5 min進行誘變。

2.2.2?多次重復誘變

經測定，出發菌株的菌落直徑平均為11.50 mm，經過第1次2.5 min紫外線照射后，挑選出了28個產孢快、孢子豐富、平均菌落直徑為15.25 mm的正突變株做成孢子懸浮液進行第2次紫外線誘變;經過第2次紫外線誘變后又篩選出了產孢較快、孢子豐富、平均菌落直徑為18.75 mm的6個單菌落，將這6個單菌落制成孢子懸浮液進行第2次紫外線誘變后，長出來的單菌落中沒有同時滿足直徑大于18.75 mm，且產孢快、孢子豐富這兩個篩選條件的，說明從表觀看誘變效果已無明顯增加。因此，將第2次誘變后獲得的6株突變株分別編號為Nr?UVY1、Nr?UVY2、Nr?UVY3、Nr?UVY4、Nr?UVY5、Nr?UVY6。

2.3?抗敵敵畏突變株的篩選

分別將紫外誘變突變株Nr?UVY1、Nr?UVY2、Nr?UVY3、Nr?UVY4、Nr?UVY5、Nr?UVY6配制成107個/mL濃度的孢子懸浮液，在不同濃度敵敵畏含藥平板上進行第1次藥劑理化誘變，理化誘變結果如表3。

1） 表中“+”代表菌株能生長，“-”代表菌株不能生長。下同。

+， the strains can grow;-， the strains cannot grow. The same below.

從表3可以看出，6株紫外突變株經過第1次藥劑理化誘變后在敵敵畏濃度為968 mg/L的含藥培養基均能生長;在出發菌株的致死濃度1 291 mg/L的含藥培養基上，除了Nr?UVY2、Nr?UVY5兩株不能生長，其余4株突變株均能生長;在濃度大于1 291 mg/L的平板上，6株突變株均無法生長。

選擇能在含1 291 mg/L敵敵畏的含藥培養基上生長的突變株Nr?UVY1、Nr?UVY3、Nr?UVY4、Nr?UVY6，挑取菌落直徑大、產孢快的單菌落做成孢子懸浮液，在含藥平板上繼續進行第2次藥劑誘變，結果如表4。

從表4可以看出，4株突變株在敵敵畏致死濃度1 291 mg/L的含藥培養基上都可以生長且正常產孢;在含藥濃度為1 937 mg/L的平板上除了Nr?UVY3不能生長，原來在此濃度下不能生長的突變株Nr?UVY1、Nr?UVY4、Nr?UVY6均可以生長且產孢，突變株Nr?UVY6同樣長勢最好、產孢較快;在更高濃度的2 583 mg/L含藥平板上只有Nr?UVY6能生長但產孢較少、菌落直徑小;而在濃度大于2 583 mg/L的所有含藥平板上均未見菌落出現。因此，選擇能在1 937 mg/L的含藥平板上生長的Nr?UVY1、Nr?UVY4、Nr?UVY6繼續進行第3次藥劑理化誘變，同樣挑取菌落直徑大、產孢快的單菌落做成孢子懸浮液，在含藥平板上進行理化誘變，理化誘變結果見表5。

從表5可以看出，3株突變株在含敵敵畏濃度1 937 mg/L的平板上均能夠生長，而在含敵敵畏2 583 mg/L的培養基上，突變株Nr?UVY6仍然能夠生長;原來不能在此濃度下生長的突變株Nr?UVY1也可以生長且正常產孢，但長勢不如突變株Nr?UVY6;在含敵敵畏3 875 mg/L的培養基上，原來經過第2次理化誘變后不能在此濃度下生長的突變株Nr?UVY1、Nr?UVY6現在可以生長，而Nr?UVY4依然不能生長;在濃度大于3 875 mg/L的含藥平板上均未見菌落生長。因此選擇能在含藥濃度為3 875 mg/L的平板上生長的突變株Nr?UVY1、 Nr?UVY6進行第4次藥劑誘變，結果如表6。

表6顯示，突變株Nr?UVY1、Nr?UVY6經過第4次理化誘變后，與第3次的結果一樣，依然不能在含敵敵畏5 166和7 750 mg/L的平板上生長，說明誘變效果已無明顯正突變，因此3 875 mg/L即為所有突變株對敵敵畏的最高耐藥濃度，Nr?UVY1、Nr?UVY6即為篩選到的抗藥性突變株。

2.4?突變株對敵敵畏的抗性水平

由表7可知，未經誘變的出發菌株的EC50最小，為851 mg/L，與2株突變株的EC50在0.05水平上有顯著差異，但突變株Nr?UVY1和Nr?UVY6之間無顯著性差異。經過誘變處理的兩株突變株對敵敵畏的抗性水平不同。突變株 Nr?UVY1對敵敵畏的抗藥性稍弱，抗性比為2.22，其EC50為1 888 mg/L;而突變株Nr?UVY6對敵敵畏的抗藥性較強，抗性比為2.57，EC50為2 184 mg/L。突變株Nr?UVY6的抗性水平高于突變株Nr?UVY1，并且2個突變株的抗性水平都高于出發菌株，說明經過紫外線誘變加藥劑理化誘變后萊氏綠僵菌對敵敵畏的抗藥性明顯提高。

1） 采用Duncan氏多重分析法比較，同列數據后不同字母表示在0.05水平差異顯著（P<0.05，N=3）。

Different letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level by using Duncans multi?analysis method （P<0.05， N=3）.

2.5?突變株的遺傳穩定性

從表8可以看出，突變株Nr?UVY1和Nr?UVY6經過連續轉接7代后，敵敵畏對2株突變株的生長抑制率差異不大，說明經過紫外線誘變加藥劑理化誘變后得到的突變株Nr?UVY1、Nr?UVY6對敵敵畏的抗藥性遺傳基本穩定。隨著轉接代數的增加，可以看出敵敵畏對突變株Nr?UVY1的生長抑制率緩慢增加，增加幅度明顯大于突變株Nr?UVY6，說明突變株Nr?UVY6的遺傳穩定性更好。因此，無論從對敵敵畏的抗性水平還是遺傳穩定性來看，突變株Nr?UVY6均優于Nr?UVY1。

3?討論

試驗通過萊氏綠僵菌出發菌株在含不同濃度敵敵畏平板上的生長情況對比得出敵敵畏對萊氏綠僵菌孢子的致死濃度為1 291 mg/L，這與邱思鑫等[4]得出的80%敵敵畏乳油1 000倍稀釋液對萊氏綠僵菌孢子萌發的抑制率達88.68%的結果有一定出入，分析原因可能有兩個： 一是不同地域、不同寄主的萊氏綠僵菌由于生物學性狀不同造成對殺蟲劑的耐受性不同。龍亞飛等[12]曾對來自河南、山東、安徽的萊氏綠僵菌菌株對農用多抗霉素的敏感性進行過測定，結果表明來自安徽和山東的萊氏綠僵菌菌株對農用多抗霉素比較敏感，而來自河南的萊氏綠僵菌菌株則對農用多抗霉素具有較強的抗藥性。邱思鑫所用試驗菌株分離自福州郊區蔬菜地斜紋夜蛾，而本試驗所用菌株分離自大邑縣杜仲種植基地自然感染萊氏綠僵菌而死的杜仲夢尼夜蛾，因此，不同地域的萊氏綠僵菌對同一農藥的敏感性不盡相同。二是化學農藥的長期使用已經使得一些生防菌對化學農藥產生了一定的抗藥性，實際上長期的農藥選擇壓力也是提高菌株耐藥性的一種方法，但是因為其周期較長而不被使用。而敵敵畏等有機磷殺蟲劑在以往的長期使用中，對人類、動植物以及生態環境帶來了諸多負面影響。因此有必要通過誘變手段提高萊氏綠僵菌的耐藥性，為萊氏綠僵菌在田間的推廣使用打下基礎。

本試驗以經過紫外線誘變后致死率在70%～80%之間為標準，得出了適合萊氏綠僵菌紫外線誘變的最佳照射時間為2 min和2.5 min;經過兩次紫外線照射后篩選出了6株產孢較快，孢子豐富，平均菌落直徑為18.75 mm的突變株，分別編號為Nr?UVY1、Nr?UVY2、Nr?UVY3、Nr?UVY4、Nr?UVY5、Nr?UVY6。

由于紫外線照射時其波長主要集中在255 nm附近，這與多數細菌的DNA 吸收光譜相一致[13]， 所以紫外線在使真菌發生誘變的同時還對細菌具有較強的致死作用，大大減少了真菌培養過程中被細菌污染的概率，是一種理想的誘變方式。但由于紫外線作用位點的隨機性，誘變帶來的效果也是隨機的，可能發生正突變，也可能發生負突變。比如王興民等[14]對玫煙色棒束孢進行紫外線誘變后，結果顯示經過不同時間的紫外線照射后，玫煙色棒束孢sp.1菌株的菌落生長和產孢量存在一定差異，有些處理的菌落直徑和產孢量大于出發菌株，有些則小于出發菌株。彭燕[15]對放線菌BM10、許天委[16]對金龜子綠僵菌MA4進行紫外線誘變的結果顯示處理后的菌落直徑和產孢量也存在不同差異，需要對萊氏綠僵菌出發菌株進行進一步的藥劑誘變以得到穩定的抗藥性突變株。

現已有許多學者采用紫外線加藥劑誘變的方式提高了出發菌株對農藥的耐藥性[1718]。本試驗經過2次紫外線誘變加4次藥劑理化誘變后，篩選得到了能在含敵敵畏濃度為3 875 mg/L的平板上生長的突變株Nr?UVY1和Nr?UVY6。突變株Nr?UVY1、Nr?UVY6的抗性水平分別是出發菌株的222倍、2.57倍，說明萊氏綠僵菌經過紫外線加藥劑理化誘變后對敵敵畏的耐藥性有所提高。但與拮抗性木霉[19]經紫外線誘變加藥劑誘變后耐藥性提高100多倍、哈茨木霉[20]經誘變后耐藥性提高300多倍、金龜子綠僵菌[16]經誘變后耐藥性提高120倍的結果相比較，萊氏綠僵菌誘變后耐藥性提高的效果遠不如上述幾種生防菌。分析原因可能有以下兩個： 第一是誘變時間較短。本試驗統一采用2.5 min作為誘變時間，而哈茨木霉、拮抗木霉均經過80 min的誘變。試驗發現致死和變異作用并非同一過程的平行效應[21]，即高劑量的誘變雖然會增加菌株的變異幾率，但其弊端是造成的損傷大且負突變比例較高，不利于目標菌株的分離篩選;而低劑量的誘變則相反，它造成的損傷較小且正突變比例較高，有利于目標菌株的分離篩選，但其弊端就是突變幾率降低，因此誘變效果隨之較低;第二則可能是萊氏綠僵菌自身基因穩定性所決定。有研究表明[22]，金龜子綠僵菌經誘變后產生的不同抗藥性可能是由于編碼β?微管蛋白的相應基因發生了突變，在不同位點的突變表現了不同的抗藥水平，因此對萊氏綠僵菌發生突變的位點進行更深入的研究將有助于解釋為何萊氏綠僵菌經過紫外線誘變加藥劑誘變后其抗藥性提高幅度不如上述幾種生防菌。

突變株Nr?UVY1和Nr?UVY6經過連續轉接7代后，對敵敵畏的抗藥性遺傳均基本穩定，說明萊氏綠僵菌在經過紫外線誘變加藥劑誘變后產生抗藥性的相關基因位點比較穩定，對相關基因位點的研究、相關基因的克隆將有助于闡釋萊氏綠僵菌抗藥遺傳穩定性的分子機制，為萊氏綠僵菌在農林生產中的長期應用奠定理論基礎。

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（責任編輯：田?喆）