多抗霉素B在鮮人參中的儲藏穩定性

張睿泓 侯志廣 李廣領 李迎東 馮達 李忠華 張鑫宇 逯忠斌

摘要 ：建立了鮮人參樣品中多抗霉素B的簡易樣品前處理程序和HPLC?MS/MS檢測方法，對0～150 d低溫儲藏的鮮人參添加樣品進行了分析，考察了多抗霉素B在鮮人參樣品中的低溫儲藏穩定性。結果表明，所建立分析方法在0.01～2.0 mg/L范圍內線性響應良好，0.2～5.0 mg/kg添加水平的平均回收率為78.0%～94.7%，定量檢測限為0.275 mg/kg;鮮人參樣品在-18℃和-20℃儲藏條件下多抗霉素B的平均降解率均小于30%，說明多抗霉素B在鮮人參樣品中至少可以穩定儲藏150 d。該結果為多抗霉素B在人參上的殘留登記試驗提供了可靠的科學依據。

關鍵詞 ：多抗霉素B;?人參;?高效液相色譜質譜;?儲藏穩定性

中圖分類號：

S 451.2

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018468

Storage stability of polyoxins B in fresh Panax ginseng

ZHANG Ruihong，?HOU Zhiguang，?LI Guangling，?LI Yingdong，

FENG Da，?LI Zhonghua，?ZHANG Xinyu，?LU Zhongbin

（College of Resource and Environment， Jilin Agricultural University， Changchun?130118， China）

Abstract

In order to investigate the low temperature storage stability of polyoxins B in fresh Panax ginseng samples， the spiked fresh P.ginseng which were stored at -18℃ and -20℃ for 0-150 days were analyzed by the established simple pretreatment program and high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry detection method. The results showed that the established method had a good linear response in the range of 0.01-2.0 mg/L， the average recovery of polyoxins B spiked at 0.2-5.0 mg/kg in blank P.ginseng was between 78.0% and 94.7%， and the limit of quantitative detection was 0.275 mg/kg. The average degradation rate of polyoxins B in fresh P.ginseng samples was less than 30% at -18℃ and -20℃， indicating that polyoxins B can be steadily stored for at least 150 days in fresh P.ginseng samples. This result provides a reliable scientific basis for the polyoxins B residue field trials on P.ginseng field.

Key words

polyoxins B;?Panax ginseng;?high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry;?storage stability

在農藥登記殘留試驗中，農藥殘留試驗樣品從田間取樣后往往會因分析儀器、工作安排或人員調配等原因被儲藏一段時間后才被檢測。殘留農藥在樣品中的儲藏穩定性對農藥殘留分析工作至關重要，另外它也是農藥登記試驗數據的重要組成部分[1]。

研究表明，農藥在樣品中的儲藏穩定性主要取決于殘留農藥自身的理化性質、樣品基質特性和儲藏溫度條件三個方面。Afridi 等[2]在對小麥籽粒中氯菊酯、甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷的儲藏穩定性的研究中發現，儲藏穩定性與殘留農藥的飽和蒸汽壓和水溶性呈明顯的負相關關系;Mouvet等[3]比較了水溶性有差異的滅草松、異丙隆、甲草胺和特丁津4種除草劑在水中4℃條件下的儲藏穩定性，也發現這4種除草劑的水溶性與儲藏穩定性存在負相關關系;Leahey等[4]發現稻谷和小麥樣本含水量與其中的甲基立枯磷殘留的常溫儲藏穩定性成反比;Kobayashi等[5]對黃瓜、香梨和馬鈴薯中乙撐硫脲在-20℃下的儲藏穩定性進行了研究，發現乙撐硫脲在pH低的基質里降解速率低于高pH基質;Athanasopoulos等[6]研究了葡萄中甲胺磷常溫和0℃下的儲藏穩定性，發現0℃下儲藏的半衰期為267 d，比常溫下高出一個數量級;魏梅等[7]比較了室溫、4℃和-20℃3個儲藏溫度下聯苯菊酯和甲氰菊酯在柑橘勻漿物中的儲藏穩定性，發現隨著儲藏溫度降低，兩種菊酯類農藥在柑橘中的儲藏穩定期均表現為增長趨勢;董見南[8]研究了10種有機磷殺蟲劑和8種殺菌劑殘留在甘藍、番茄和柑橘等7種代表性基質中的儲存穩定性，同樣發現低溫儲藏不利于儲藏過程中殘留農藥的降解。殘留試驗樣品的儲藏，需要綜合考慮待試農藥的理化性質及樣品基質，并合理地確定儲藏條件和儲藏時間，這樣才能確保儲存期間待測物的性質和含量不發生變化，從而確保分析結果的可靠性和科學性。

多抗霉素B（polyoxins B）為生物源抗生素農藥，具有高效、安全、低風險的特點，符合當今食品安全、藥品安全和生態安全的大方向，其在防治由Alternaria panax Whetz導致的人參黑斑病方面應用潛力巨大。本研究采用模擬添加法，建立并優化鮮人參樣品中多抗霉素B殘留的高效、高靈敏度的HPLC?MS/MS分析方法，研究不同儲存溫度下鮮人參中多抗霉素B殘留的儲藏穩定性，為推薦多抗霉素B在人參上登記試驗的樣品有效儲藏期提供數據支持。

1?材料和方法

1.1?藥品、試劑與供試材料

色譜純甲醇、甲酸、乙腈（購自MREDA公司），分析純乙酸銨（購自北京鵬彩精細化工有限公司），多抗霉素B標準品（純度29.0%，購于Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

鮮人參根采自吉林省撫松縣有機人參種植基地。

1.2?主要儀器設備

1260系列HPLC（Agilent Technology Inc.，USA），配置真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和二元泵。6470型三重四極桿質譜儀、SHZ?88型恒溫水浴振蕩器、IKA T25型高速分散機、YXJ?A型高速大容量電動離心機、IKA VORTEX 3型渦旋儀等。

1.3?試驗設計

將采集的有機鮮人參樣品勻漿液與多抗霉素B標準溶液充分混勻，使多抗霉素B在人參樣品中的最終含量分別為1 mg/kg和2 mg/kg。將每5 g混合樣品分裝于1個50 mL聚丙烯離心管中，分別置于-18℃和-20℃冷凍條件下儲存，按0、7、14、28、60、90、120和150 d間隔期取樣分析，各次的樣品均設3次重復，共計96個樣品，另設空白對照和1 mg/kg的質控樣品。

1.4?樣品前處理

將不同溫度下的冷藏樣品從冰箱中取出，平衡至室溫，加入0.3%甲酸25 mL，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min，移取1 mL上清液，過0.22 μm濾膜至HPLC進樣小瓶，待HPLC?MS/MS分析。

1.5?色譜和質譜條件

Agilent Zorbax C18分離分析柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），以0.5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸的溶液（A）和乙腈（B）為流動相，梯度洗脫程序為0～1 min內，B由5%增至10%;1～2 min內，B由10%增至20%;2～3 min內，B由20%增至30%;3～4 min內，B由30%增至40%;4～5 min內，B由40%增至60%;5～7 min內，B由60%降至40%;7～9 min內，B由40%降至10%;9～10 min內，B由10%降至5%;平衡5 min。設柱流速0.3 mL/min、柱溫恒定30℃、進樣5 μL。根據儀器廠商推薦設定質譜各種氣體參數、離子源溫度、離子噴射電壓，其他參數見表1。

1.6?方法性能

分別用10%甲醇將1 000 mg/L質量濃度的多抗霉素B標準溶液稀釋成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L系列濃度的標準溶液;參照1.4描述的樣品前處理程序處理空白人參樣品，獲得空白人參樣品提取液，再將不同濃度的多抗霉素B標準溶液溶于相同體積的空白樣品提取液制得0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L系列濃度的基質標準溶液。在1.5儀器條件下進樣分析，分別以進樣濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，擬合出線性回歸方程，評價線性關系，并計算方法的檢出限（LOD）及定量限（LOQ）。用基質匹配標準曲線評價基質效應（matrix effects， ME），如果ME≤10%，可忽略樣品基質的影響，如果ME>10%，需用基質匹配標準曲線進行定量校準，以減小基質的影響。

采用模擬添加法，用有機鮮人參樣品勻漿液進行多抗霉素B的添加回收率試驗，添加水平分別為0.2、1.0 mg/kg和5.0 mg/kg，各添加水平分別做5次重復，分別用計算得到的添加回收率和相對標準偏差表示準確度和精密度。

2?結果與分析

2.1?方法的線性、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

圖1中a為1 mg/L多抗霉素B標準品的定量離子流色譜圖、b為多抗霉素B的兩個選擇離子的質譜圖，c為定性離子色譜圖，圖2為人參空白樣品基質的兩個選擇離子色譜圖（a，c）和質譜圖（b）。

由圖1和圖2可以看出，本研究所用人參樣品不含多抗霉素B，且在確定的色譜/質譜條件下，多抗霉素B與人參基質無干擾。

多抗霉素B在純溶劑中和在空白人參樣品基質中的線性回歸方程分別為y=3.8x-17.7（R2=0.999 5）和y=1.7x+22.7（R2=0.997 1），說明在確定的儀器條件下，多抗霉素B在0.01～2.0 mg/L質量濃度范圍內進樣濃度和色譜峰積分面積有良好的線性響應。通過在空白基質提取液中添加少量適當濃度的多抗霉素B標準溶液進樣分析，并分別根據3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）計算出的多抗霉素B的LOD為0.413 ng，LOQ為0.275 mg/kg。

2.2?基質效應

基質效應是基質成分復雜的樣品HPLC?ESI?MS/MS分析中較常見的現象，一般認為是由于待測組分與樣品基質在ESI過程中霧滴表面離子化的競爭造成的，該結果可能會顯著地抑制或增強目標離子的生成效率及離子強度，進而影響到檢出限、定量限、線性、準確度和精密度等方法性能指標[9]。文獻報道的基質效應補償措施主要有采用基質匹配標準曲線法、樣品稀釋法和應用分析物保護劑[10]，其中基質匹配標準曲線法是最常用、最簡單，也是有效的方法。根據文獻介紹方法[11]計算的多抗霉素B在空白人參樣品基質中基質效應值（ME）為56%，說明有明顯的基質增強效應，因此，本研究中采用基質匹配標準曲線法對人參樣品基質中的多抗霉素B進行定量校準。

2.3?方法的準確度和精密度

鮮人參空白樣品中0.2、1.0 mg/kg和5.0 mg/kg添加水平的回收率和相對標準偏差（RSD）見表2。其中0.2 mg/kg添加水平的平均回收率為94.7%，5次重復的RSD為4.2%;1.0 mg/kg添加水平的平均回收率為74.7%，5次重復的RSD為3.2%;5.0 mg/kg添加水平的平均回收率為78.0%，5次重復的RSD為1.3%。

2.4?儲藏穩定性

按照1.3中的試驗設計，根據公式（1）計算樣品儲藏過程中多抗霉素B殘留的降解率，當人參在冷凍條件下儲存時，人參中的多抗霉素B殘留能夠保持穩定長達5個月，可以看出，隨著樣品采集間隔的增長，在鮮人參基質中的殘留雖不同程度的減少，但仍然趨于穩定。

D=C0-CtC0×100（1）

式中：D為降解率，單位為百分率（%）;C0為樣品的初始濃度，單位為毫克每千克（mg/kg）;Ct為樣品的檢測濃度，單位為毫克每千克（mg/kg）。

由表3可以看出，空白鮮人參中1 mg/kg多抗霉素B添加水平分別在-18℃和-20℃下儲藏0、7、14、28、60、90、120和150 d后多抗霉素B降解率最大為13.18%;整個儲藏過程中，各時間點的樣品中多抗霉素B降解率均小于30%，根據植物源性農產品中農藥殘留儲藏穩定性判斷標準[12]，空白鮮人參中1 mg/kg多抗霉素B添加水平分別在-18℃和-20℃下150 d儲藏期間內穩定。

由表4可以看出，空白鮮人參中2 mg/kg多抗霉素添加水平分別在-18℃和-20℃下儲藏0、7、14、28、60、90、120和150 d后多抗霉素B降解率最大為14.86%;-18℃和-20℃下，各時間點的樣品中多抗霉素降解率均小于30%，根據植物源性農產品中農藥殘留儲藏穩定性判斷標準[12]，空白鮮人參中2 mg/kg多抗霉素添加水平分別在-18℃和-20℃下150 d儲藏期間內穩定。

3?結論與討論

農藥在生物樣品中的低溫儲藏穩定性是農藥登記殘留試驗的基礎資料，而儲藏穩定性研究具有周期長的特點，在較長的試驗周期內難以保證各項試驗條件的穩定性以及每次試驗操作的重復性，為了盡可能減小所獲取數據的波動，本研究引入質控樣品對每次獲取的檢測數據進行回收率校準，保證了數據的可用性。本文通過建立鮮人參樣品中多抗霉素B的簡易樣品前處理程序和靈敏、可靠的HPLC?MS/MS檢測方法，對添加多抗霉素B的鮮人參樣品經低溫儲藏，并進行了漸進性測定，結果表明，150 d內各次檢測數據均圍繞質控上下波動，且在-18℃和-20℃儲藏條件下多抗霉素B在鮮人參樣品中的降解率均低于30%，說明兩個儲藏條件下生物農藥多抗霉素B在鮮人參樣品中150 d儲藏期內穩定，該研究為多抗霉素B在人參上的殘留登記試驗提供了科學依據。

參考文獻

[1]?朱光艷，張志勇.美國EPA農藥登記殘留試驗中樣品儲藏穩定性試驗[J].農藥科學與管理，2014，35（12）：3037.

[2]?AFRIDI I A K，PARVEEN Z，MASUD S Z.Stability of organophosphate and pyrethroid pesticides on wheat in storage [J].Journal of Stored Products Research，2001，37（2）：199204.

[3]?MOUVET C，JEANNOT R，RIOLLAND H，et al.Stability of isoproturon，bentazone，terbuthylazine and alachlor in natural groundwater，surface water and soil water samples stored under laboratory conditions [J].Chemosphere，1997，35（5）：10831097.

[4]?LEAHEY J P，CURL E A.The degradation of pirimiphas?methyl on stored grains [J].Pest Management Science，1982，13（5）：467474.

[5]?KOBAYASHI H，NISHIDA M，MATANO O，et al.Effect of cysteine on the stability of ethylenethiourea and ethylenebis （dithiocarbamate）in crops during storage and/or analysis [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40（1）：7680.

[6]?ATHANASOPOULOS P E，PAPPAS C，KYRIAKIDIS N V，et al.Degradation of methamidophos on soultanina grapes on the vines and during refrigerated storage[J].Food Chemistry，2005，91（2）：235240.

[7]?魏梅，孫大利，張耀海，等.3種高檢出農藥在柑桔檢測樣品中的穩定性研究[J].中國南方果樹，2016，45（3）：2126.

[8]?董見南.10種有機磷殺蟲劑和8種殺菌劑殘留在代表性水果蔬菜中的儲存穩定性[D].北京：中國農業大學，2014.

[9]?TRUFELLI H，PALMA P，FAMNGLINI G，et al.An overview of matrix effects in liquid chromatography?mass spectrometry [J].Mass Spectrometry Reviews，2011，30（3）：491509.

[10]LI Yan，CHEN Xi，FAN Chunlin，et al.Compensation for matrix effects in the gas chromatography?mass spectrometry analysis of 186 pesticides in tea matrices using analyte protectants[J].Journal of Chromatography A，2012，1266（6）：131142.

[11]ZHU Yulong，LIU Xingang，XU Jun，et al.Simultaneous determination of spirotetramat and its four metabolites in fruits and vegetables using a modified quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe method and liquid chromatography/tandem mass spectrometry [J].Journal of Chromatography A，2013，1299（14）：7177.

[12]農業部農藥檢定所.NY/T 3094?2017[S].北京：中國農業出版社，2017.

（責任編輯：楊明麗）