糜蛋白酶C基因在胰腺疾病中的研究進展

汪 洋，嚴茂林，陳和平

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072；2電子科技大學醫學院，四川 成都 610051)

胰腺為腹膜后臟器，是人體重要的消化器官，分為內分泌腺和外分泌腺兩部分，糜蛋白酶C(CTRC)主要涉及外分泌功能。胰腺疾病包括胰腺炎癥和胰腺腫瘤等，胰腺炎癥大體分為急性胰腺炎(AP)和慢性胰腺炎(CP)，急性復發性胰腺炎(RAP)可以轉變為慢性胰腺炎，由慢性胰腺炎到胰腺上皮內瘤(PanIN)變最后到胰腺癌(PC)是一個漸變過程。CTRC基因是新近發現的CP易感基因，其突變可增加CP患病風險，會加重RAP發展到CP的病程[1]。此外，更好地了解病因因素與易感SNP的相互作用將有助于在早期階段診斷和治療該疾病。目前迫切需要利用基因組學上的進步，即GWAS和/或外顯子組測序在NGS平臺上解開尚未確定的胰腺炎易感性位點。CTRC基因突變可能導致PC的發生[2]，目前尚需更多的來自不同地區的實驗來探討PC中存在的CTRC基因突變；CTRC在PC低表達，并與PC侵襲轉移有關，了解CTRC在胰腺癌前病變與癌癥之間表達差異可以進一步預測該蛋白能否作為診斷標記物。本文對胰腺疾病中CTRC基因變異的研究進展做一綜述。

1 CTRC結構、功能及基因定位

CTRC由252個氨基酸組成，包含5對二硫鍵和絲氨酸/組氨酸及天冬氨酸組成的催化中心。其編碼基因(OMIM*601405)位于染色體1p36.21上，包含8個外顯子，長度8.2 kb。人類CTRC基因位于ELA2A和ELA2B基因附近，CTRC和ELA2A之間的序列同源程度高于CTRC和CTRB1或CTRB2之間的序列同源程度。

CTRC基因編碼胰凝乳蛋白酶C，一種消化酶。它是由胰腺腺泡細胞產生，導管細胞分泌的蛋白酶原，與酶原顆粒一起包裝，并與胰腺中的其他消化酶一起分泌。CTRC在十二指腸被胰蛋白酶激活。活化后的CTRC具有很多生理功能：①促進胰蛋白酶原的自動激活：CTRC切割胰蛋白酶原的第18位苯丙氨酸和19位門冬氨酸結合處的肽鍵以及N端的三肽，從而清除胰蛋白酶原及其活化肽之間的靜電作用，進一步促進胰蛋白酶原的自動激活。②促進胰蛋白酶/酶原的降解：通過切割胰蛋白酶原鈣結合環內的第81位亮氨酸和82位谷氨酸之間的肽鍵，來促進胰蛋白酶/酶原的降解。兩者降解的差異主要在CTRC能更快地切割陽離子胰蛋白酶原的Leu81-Glu82肽鍵，在陽離子胰蛋白酶原的Leu81-Glu82鍵斷裂后，CTRC進一步以緩慢速率消化Leu41-Asn42肽鍵。CTRC在高位腸道促進酶原的激活，在低位腸道促進酶原的降解。腸內高鈣環境會封閉鈣結合環內的切割位點，使得胰蛋白酶原的降解作用是弱的，胰腺分泌的鈣濃度是極微量的(以亞豪克為單位)，故CTRC占優勢的功能是降解，保護胰腺內胰蛋白酶原不能提前激活。③輔助活化羧肽酶A1和A2：CTRC通過使前肽的α-螺旋連接片段蛋白水解而發揮作用，前肽解離并完全降解，使羧肽酶具有完全的活性。CTRC在多個位點切割前肽中的連接區段，但多保守在Leu96-Leu97肽鍵。

2 CTRC基因與AP

關于AP中CTRC基因的研究方向，目前主要在研究基因突變和基因多態性兩方面。RAP的發生可能與CTRC基因突變相關，尤其是在RAP向發展CP的過程。Werlin等分析67例ARP患者發現其中有三分之一患有遺傳性胰腺炎的突變，包括罕見突變(K23R)，強調了RAP患者可能主要通過遺傳學導致疾病的發生[3]。對于CTRC基因多態性的研究多為關于SNP位點c.180C> T的分析，Koziel 等收集分析99例波蘭凱爾采地區AP樣本CTRC多態性c.180C> T與AP發病及臨床過程的相關性，發現雜合c.180C> T位點改變會增加AP發生的風險[4]，后分析221例AP患者發現病例組與對照組的CTRC突變(p.I259 V，p.V235I，p.K247R254del，p.E225 A)頻率沒有顯著差異[5]。LaRusch等也發現此常見CTRC基因位點變異c.180 C > T可作為促進RAP進展至CP的疾病調節劑，尤其合并CFTR基因變異，SPINK1基因變異，酗酒或吸煙患者可加重病程[1]。另有研究發現，伴有CTRC基因突變的脂蛋白酶缺乏的AP患者，其疾病復發的風險會增加[6]。

在兒童特發性ARP和CP，遺傳分析對于確定胰腺炎的病因有一定臨床價值[7]。Giefer等對342兒童急性胰腺炎患者研究發現，胰腺炎的發病年齡早與 CTRC突變密切相關，發病年齡較晚的兒童更可能由于非遺傳性危險因素而致病[8]。目前主要發現CTRC位點c.180C> T的變異與AP相關，尚需進一步研究其他CTRC位點改變是否與AP相關聯，尤其對于遺傳學有極大影響的兒童隊列而言。

3 CTRC基因與CP

CP是多種因素導致的胰腺進行性不可逆炎性疾病，其病理特征包括腺泡細胞萎縮壞死，間質纖維化及鈣化。臨床特征包括慢性腹痛，腹瀉，嘔吐，消化不良和糖尿病[9]。既往研究表明，疾病的發生與遺傳學因素有關[10]。危險性遺傳因素與保護性遺傳因素之間的平衡決定了CP易感性。過早活化的胰蛋白酶被CTRC通過作用于無鈣的鈣結合環內的分子而被破壞，因此CTRC可做胰腺炎發病機制中的關鍵候選基因。Paliwal等對621例特發性或遺傳性CP和614名德國對照者的CTRC基因全部8個外顯子(8.2 kb)進行測序，確定大部分變異在第2，第3和第7外顯子。后對280例CP患者外顯子2，3和7測序，發現了許多錯義和缺失突變。在胰腺炎組中兩種最常見基因改變是c.760C> T(p.R254W)和c.738761del24(p.K247R254del)，兩者均位于外顯子7。此外，該研究組還研究了71例印度熱帶胰腺炎患者，提示該人群CTRC基因改變的頻率較高，與德國隊列相比，在印度隊列中最常見的兩種基因改變為c.217 g> A(p.A73T)錯義改變和c.190193del ATTG(p.I64LfsX69)移碼缺失。有研究表明與印度CP顯著相關的變異位點為p.A73T和c.180C> T[11]。上述研究均表明CTRC基因突變譜在歐美與亞洲國家有差異，另有研究表明在亞洲不同國家之間其突變譜與致病性也不一致。Sun-Mi Cho等在116例韓國CP隊列中發現突變p.P249L，雖然這一突變在先前歐洲研究中是致病性的，但在此特發性胰腺炎隊列中不起作用[12]。Masamune等[13]在日本CP患者中發現了5種新的錯義突變(8/506)。然而，只有三種變異，包括p.R29Q，p.S239C和p.R254W，在功能上被證明是有害的[14，15]。我國對于CTRC基因突變研究較少，僅臺灣地區分析報道了126例成人CP患者中CTRC基因突變頻繁的實驗數據，包括c.673 g>A等在內的10個先前未發現的位點改變[16]。除此之外，有兩項關于兒童CP的研究，一項中國兒科ICP患者的隊列研究沒有發現任何CTRC的致病突變[17]；另一項上海的研究在兒童CP中僅發現一例突變[18]。

CTRC基因突變導致的功能效應是CP可能的發病機制，這些功能效應主要包括四個方面：①分泌受損：Derikx等報道轉染突變p.G61R的HEK 293 T細胞中CTRC的分泌是不可測量的[19]。在用重組腺病毒轉染的AR42 J大鼠腺泡細胞系中觀察到由p.A73T突變引起的分泌缺陷[20]。移植突變p.I64LfsX69和p.G103 VfsX31以及無義突變p.W55X也預期會導致CTRC分泌的完全喪失，但缺乏直接的實驗證明；②催化活性下降：Chee等研究發現具有p.K247R254del和p.G217 S突變的CTRC無催化活性，而具有p.Q48R和p.A73T突變的CTRC酶活性降低[21]；③被胰蛋白酶降解：突變體p.G217R，p.G217 S和p.K247R254del在低胰蛋白酶/CTRC比率條件下幾乎完全降解[14]；④增加內質網應激的傾向：CTRC突變可誘導蛋白的錯誤折疊，引起ER應激，激活炎癥轉錄因子核因子κB(NF-κB)，隨后腺泡細胞死亡，進而導致CP。ER應激相關的CTRC突變通過SIRT2介導的微管失調減少胰腺酶原分泌[22]。

4 CTRC基因與胰腺上皮內瘤變

胰腺上皮內瘤變(PanIN)是一種顯微鏡下的扁平或乳頭狀非侵襲性病變，主要發生在直徑小于10 mm的小胰管，內襯一定程度異性的柱狀或立方細胞。根據結構和細胞核異性程度可以將PanIN分為PanIN-1，PanIN-2和PanIN-3三個等級，其中PanIN-1可以進一步分為PanIN-1A和PanIN-1B。PanIN是胰腺導管腺癌(PDAC)最常見的前體病變，可經過多個階段的組織學和遺傳學改變進展至PDAC。在遺傳學方面，PanIN和PDAC存在多種相同的分子改變，包括K-ras基因激活突變，Smad4表達缺失，c-erbB-2基因過表達等。Buchholz等研究基因表達譜發現，基因表達的最大變化發生在PanIN分期1B和2之間，表明PanIN-2可能代表PDAC進展中的第一個真正的腫瘤前期階段[23]。此研究還發現與正常胰腺組織相比，CTRC基因在PanIN表達顯著增高，尤其在PanIN-2，此外PanIN與胰腺導管腺癌相比，CTRC基因表達亦有顯著差異，提示CTRC可能標記PanIN的重要性。目前尚缺乏胰腺癌前病變與CTRC基因相關性的研究，需要更多的實驗探討兩者之間可能的聯系，同時進一步證實當前的發現。

5 CTRC基因與胰腺癌

胰腺癌惡性程度極高，預后差，5年生存率不足7%[24]。在美國消化道腫瘤相關死亡率中排第四名。據美國癌癥協會統計數據表明，僅9%的患者在腫瘤早期或局限期被診斷胰腺癌，5年生存率約為25%，而約53%的患者在確診時已處于腫瘤晚期，5年生存率僅2%[25]。CTRC基因突變可能導致胰腺癌的發生。有研究表明，伴有CTRC基因突變的慢性胰腺炎患者，患胰腺癌的風險將增加。波蘭一項納入16例胰腺癌患者的研究CTRC多態性p.G60 =(c.180C>T)在胰腺癌患者中頻繁出現[2]。目前發現CTRC基因多態性c.180C>T改變廣泛存在CP及PC中，是否提示伴有此多態性位點改變的患者會影響CP向PC進展。與上述研究不同的是，對德國121例PC患者研究發現CTRC基因突變似乎不顯著增加胰腺癌的風險[26]。在CTRC基因拷貝數變異上肉瘤改變最為顯著，其次未淋巴瘤，而胰腺癌無統計學差異，說明PC中CTRC基因改變主要在于基因突變和基因多態性改變，而非基因拷貝數變異。考慮到CTRC在PanIN與PC中的差異表達，是否可以在癌癥早期階段通過檢測組織或分泌到血液中CTRC的表達來達到早診斷。早治療的目的。目前尚需要進一步實驗探討在胰腺癌與癌前病變之間CTRC基因改變與表達的差異，并明確血液中CTRC在兩種疾病間的表達差異趨勢是否與組織上一致。

綜上所述，CTRC基因改變在多種胰腺疾病中被發現，并參與胰腺疾病的進展過程。隨著遺傳學的發展，人們對于胰腺疾病與CTRC基因的相關性理解得到了很大的提高。應建立理想的動物模型，找到關鍵的發病機制，并將其應用于臨床，為急慢性胰腺炎的治療提供新的思路。同時后續需要大量深入研究來探討CTRC基因突變在胰腺癌中的功能效應，以及CTRC與胰腺癌相關表型的相關性，為PC的診斷和防治提供新的策略。