液體活檢在腫瘤領域的研究進展

林慧嫻 鄭磊

1南方醫科大學檢驗與生物技術學院（廣州510000）；2南方醫科大學南方醫院檢驗科（廣州510000）

近年來興起的液體活檢技術克服了傳統組織活檢的侵入性、取樣困難以及難以監測等局限性，使腫瘤的實時動態監測成為可能。液體活檢技術主要針對循環腫瘤核酸（circulating tumor DNA，ctDNA）、細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）及循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）等標志物的檢測分析，具有非侵入性、重復性強等優勢，在腫瘤早期診斷、治療決策、療效評估和耐藥監測中具有巨大的發展潛力與臨床應用前景。此外，液體活檢還可反映腫瘤的基因譜，對腫瘤診治的精準化進程具有推進性意義，因此本文將對上述液體活檢的三大檢測標志物的生物學特性、主要檢測方法以及臨床應用進行簡要綜述，為證明其臨床有效性和實用性提供思路，對指導基礎實驗研究和液體活檢的臨床實踐有重要意義。

1 循環腫瘤DNA（ctDNA）

腫瘤患者外周血游離DNA（cell free DNA，cfDNA）濃度比健康人群高10～100 倍，其中ctDNA 可來源于凋亡或者壞死的腫瘤細胞、CTCs和外泌體。ctDNA 長度約為150～200 bp，其存在形式包括單鏈DNA、雙鏈DNA 及DNA-蛋白復合體，半衰期為15 min～2 h。雖然ctDNA 僅占全部cfDNA的0.01%～1%，但ctDNA的遺傳信息和腫瘤組織有良好一致性，可以動態反映腫瘤基因譜特征。

ctDNA的檢測包括濃度變化和結構改變兩個方面。因ctDNA 占cfDNA 總量的比例較低，且ctDNA 與體細胞凋亡釋放的核酸相比可能僅有一個或數個堿基的微小差別，故對其檢測技術靈敏度要求極高。以選擇性擴增為核心的技術包括熒光定量PCR、液滴式數字PCR［1］、cold-PCR［2］、ARMS-PCR［3］、高分辨溶解曲線分析技術［4］等，這類方法靈敏度較高，但易發生偏向性擴增，且只可檢測已知突變。以測序技術為核心的Sanger 測序（一代）、增強化TAM-測序［5］和CAPP-測序［6］（二代）、納米孔單分子測序［7］（三代）等方法具有高通量和高效率的優點，但成本相對較高。此外，PCR-流式聯合技術［8］、新興的微球依賴性懸浮點陣法［9］等在提高檢測準確性和降低成本方面都有一定的提升。其中微球依賴性懸浮點陣法基于液相芯片技術，靈敏度提高至可檢測低至2 μL的樣本。

2 細胞外囊泡（EVs）

EVs 是細胞在生理或病理狀態下旁分泌的一種膜性囊泡，包括凋亡小體（＞1000 nm）、微囊泡（100～1000 nm）和外泌體（30～100 nm）。EVs 存在于淋巴液、血液、唾液、尿液、腦脊液等體液中，半衰期較ctDNA 與CTCs 長。EVs可將其攜帶的脂質、蛋白質、核酸、細胞因子等物質運輸至特定部位，在細胞信號轉導、增殖與分化、炎癥反應、腫瘤轉移與耐藥等方面，發揮重要的作用。

EVs的檢測主要包括分離鑒定與內容物分析。分離技術包括差速離心法、密度梯度離心法、尺寸排阻法、微流控法和磁珠分選法等。離心法的優點是對EVs的活性損傷較小，但所需樣本量較大且分離純度較差。尺寸排阻法和微流控技術的分離效率較高，但也存在特異性不足的問題。免疫磁珠分選法具有較好的特異性，但抗原表位的激活可能不利于后續的功能分析。EVs的鑒定包括以電子顯微鏡法、納米顆粒跟蹤法、動態光散射法為主的物理學鑒定和以蛋白印記法、酶聯免疫法為主的免疫學鑒定。物理學方法通過形態和粒徑特征對EVs 進行表征，免疫學方法則通過檢測特異的表面蛋白標志物對EVs 進行鑒定和亞群分析。EVs 內容物包括蛋白質、核酸、脂質和代謝物，其分析技術主要有質譜法、流式細胞法、液滴式數字PCR法［10］、核磁共振法、表面等離子共振法［11］等。此外，近年來發展迅速的生物傳感和電化學傳感技術，如電化學“三明治”免疫夾心法［12］、將磁選與電化學檢測相結合的手持式iMEX 分析裝置［13］以及基于金屬納米顆粒直接電氧化法的多通道金芯片［14］等，均可應用于EVs 檢測分析領域。其中多通道金芯片利用特異性適配體修飾不同的金屬納米顆粒，特異性捕獲表達多種標志物的目的外泌體與微囊泡。適配體、納米材料以及電化學傳感器的聯合運用大大提高了該技術的靈敏度以及檢測效率。

3 循環腫瘤細胞（CTCs）

CTCs 是自發或者因診療操作而脫離腫瘤原發灶或轉移灶進入外周血的腫瘤細胞，半衰期為1～2.4 h。絕大多數CTCs 在短期內被免疫系統殺滅，極少數CTCs 可通過誘導血小板聚集成“物理屏障”逃避免疫殺傷，同時激活血小板釋放血管內皮生長因子、TGF-β［15］等調節因子，進而增強其遷移侵襲力并促進新血管形成［16］。雖然CTCs 數量稀少（1～10個CTC/mL），但與腫瘤轉移和復發密切相關，是腫瘤預后和監測的潛在標志物。

CTCs 檢測包括分離富集和鑒定分析兩個方面。CTCs分離富集技術包括以過濾法、密度梯度離心法、微流控法為代表的物理學方法和以CellSearch 法［17］、Anda Test 法［18］、MagSweeper 法［19］為代表的免疫分選方法。物理方法主要依賴細胞大小、密度、電泳特征的差異，具有靈敏性高、漏檢率低的優點，但是分離純度較低，且可能漏檢體積較小的CTCs。免疫方法具有較好的分離純度和特異性，但是受到表面標志物表達異質性的影響，可能導致某些CTCs亞群的漏檢。CTC-iChip［20］技術將兩種原理有機結合，先根據細胞大小進行分離，然后利用特異性抗體（CKs 或CD45）進行二次富集，提高了檢測的捕獲率與準確性。此外，納米材料和適配體體系［21］、聲學原理［22］等也開始應用于CTCs 檢測領域，端粒酶活性［23］、體內捕獲策略［24］等逐漸成為新型檢測平臺研發的切入點，有望使CTCs 富集準確性得到質的飛躍。CTCs 鑒定及下游分析技術包括免疫細胞化學法、流式細胞術、熒光定量PCR、FISH技術、二代測序技術等，可結合細胞形態和腫瘤標志物對CTCs 進行鑒定、形態/功能亞群分析以及治療/耐藥靶點檢測。

4 液體活檢在腫瘤領域的臨床應用

4.1 輔助臨床診斷和分期傳統影像學檢查未能發現病灶時，外周血中已存在ctDNA、EVs和CTCs，早期檢測這些標志物有助于腫瘤的診斷。ctDNA 異常甲基化檢測已進入結直腸癌、肺癌、胰腺癌等腫瘤篩查和診斷的臨床實踐。例如p16INK4A 啟動子［25］、SHOX2和PTGER4等基因［26］異常甲基化均可輔助肺癌的診斷。關于EVs，研究發現肺癌患者的miR-21［27］、結直腸癌患者的CRNDE-h［28］表達水平顯著升高，提示EVs 可成為腫瘤的早期診斷標志物。據報道，外泌體源性LINC00152和lncRNA-CRNDE-h 在胃癌和結直腸癌早期診斷中優勢突出。此外，研究表明CTCs 與乳腺癌［29］、非小細胞肺癌［30］、結腸癌［31］等臨床分期的關系密切。除了數量的差異，CTCs的分子特征在腫瘤分期中也具有指示作用，CTCs 中ga733.2、muc-1，、mgb1、spdef 基因表達水平與乳腺癌分期顯著相關［32］。

4.2 輔助進行療效評估以及耐藥性監測液體活檢在耐藥性檢測及療效評估中的應用引起了廣泛關注。通過檢測ctDNA的變化如乳腺癌患者HER2的異常擴增［33］，非小細胞肺癌患者T790M 突變［34］等可預測腫瘤耐藥。外泌體在腫瘤耐藥性的產生與傳遞中發揮重要的作用。胰腺癌患者外泌體分泌增多，可促進吉西他濱耐藥性的產生［35］。耐藥患者與敏感患者的外泌體蛋白表達也存在差異，例如卵巢癌鉑類藥物耐藥患者的外泌體annexin A3 表達水平明顯高于敏感組［36］。因此，外泌體可作為指示耐藥和評估療效的標志物，且抑制特異性外泌體的釋放可能可逆轉耐藥性的產生，亦可為突破腫瘤治療的耐藥性瓶頸提供新的方向。CTCs的數量及分子特征也可提示治療效果和耐藥。CTCs 根據其分子特征可分為不同的亞群，如腫瘤干細胞樣、EMT 樣和轉移起始樣CTCs等，其中根據EMT的程度又可分為上皮型、間質型、混合型亞群。有研究發現CTCs的EMT 可作為乳腺癌耐藥標志物［37］，間質型CTCs 比例減少提示治療有效，反之與疾病進展相關。因此，CTCs亞群分析有助于制定個體化、有效化、靶向化的治療方案，進一步推進腫瘤精準診治。此外，對分離出的CTCs 進行體外培養，有利于藥物敏感性機制的研究，開發相應的靶向藥物。

4.3 實時監測腫瘤的發展狀況和預后判斷傳統的組織活檢重復取樣受限，難以實現動態監測，因此臨床上治療方案的調整與預后評估困難重重。液體活檢在規避上述局限性的同時，還可綜合腫瘤異質性因素對疾病進展進行監測，并且為揭示腫瘤轉移機制提供依據。有研究［38］發現肝癌患者不同血管部位的CTCs 分布與生物學特征例如EMT 狀態存在明顯的空間異質性，對肝癌多血管CTCs 檢測有助于揭示其轉移的新機制以及預測其轉移模式。ctDNA 特征分析可溯源腫瘤的發生部位［39］，從而為腫瘤原發灶和轉移灶的判斷提供信息。此外，ctDNA的遺傳信息和腫瘤組織有良好的一致性，可作為腫瘤復發監測和預后評估的標志物。例如，ctDNA的BRAF 突變水平可作為黑色素瘤患者生存的一項預測因素［40］。另一方面，EVs 尤其是外泌體，在預后評估中也展現了極大的應用價值。EVANS等［41］指出放化療中Annexin 陽性外泌體含量和膠質母細胞瘤的早期復發與總生存期相關。乳汁外泌體TGFβ2 水平分析有助于乳腺癌進展的評估［42］。此外，大量研究表明，CTCs 是早期乳腺癌［43］、胃癌［44］、非小細胞肺癌［45］等患者的獨立預后因素。

4.4 腫瘤的靶向治療近年來，針對免疫檢查點抑制劑、血管形成和關鍵信號通路的腫瘤靶向療法逐漸成為熱點問題。ctDNA 腫瘤突變負荷、EVs 內容物圖譜、以及CTCs數量與分子表征在靶向療法群體篩選和治療方案調整中均有指示作用。Lentz 提出全血經膜濾過法［46］可減少外泌體，使部分患者的腫瘤縮小了50%以上。利用腫瘤抗原刺激自體樹突細胞，產生EVs，激活相應抗腫瘤免疫活性，可使患者病情減緩［47］。EVs 內容物也可作為有效的腫瘤靶向抑制劑，且EVs 是機體天然的內源性物質，且有較好的膜穩定性和靶向性，可作為良好的藥物傳遞載體。研究表明，針對耐藥性肺癌，外泌體包裹紫杉醇后藥效可提高至紫杉醇直接給藥的50 倍［48］。盡管尚有許多挑戰亟待解決，EVs 在靶向載藥和腫瘤免疫治療方面仍展現出巨大的發展潛力。

5 總結與展望

液體活檢作為一種非侵入性的新型檢測技術，具有取樣方便、可動態監測等優勢。針對液體活檢標志物ctDNA、EVs和CTCs的檢測分析，在腫瘤的早期診斷、耐藥監測、療效評估、預后判斷中具有重要的臨床應用價值。但是，液體活檢技術也存在一些亟待解決的問題。一方面，ctDNA、EVs和CTCs的檢測技術缺乏規范化的流程和質量控制標準，尚未有統一的臨床參考值。另一方面，如何在提高檢測特異性、靈敏性、經濟性之間取得平衡仍值得考量。目前，大多數檢測都只聚焦于一種分析物，而綜合多種血液分析物的多參數檢測可能可以大幅度改善檢測的精確度和使用范圍?；跈z測技術、基礎生物學、分子生物學等多學科發展將是液體活檢未來的方向，需要我們深入了解液體分析物的產生機理和動態變化，確認液體標志物的臨床有效性和實用性，進而推動液體活檢在腫瘤臨床診療中的廣泛應用。