非洲豬瘟的診斷方法概述

朱向博，張 麗*

（1.太原動物園，太原 030009；2.陸生野生動物疫源疫病監(jiān)測站，太原 030009）

非洲豬瘟（ASF）由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染引起，屬于高度接觸性傳染病，所有品種和年齡的豬均易感。家豬感染后因感染毒株和豬品種的不同，死亡率5%～100%。野豬感染后因野豬種類不同而臨床表現(xiàn)差異很大，其中歐亞野豬、美洲野豬的臨床表現(xiàn)與家豬類似，而非洲的疣豬、叢林野豬等多呈隱形感染，北美的花斑野豬對本病具有抵抗力[1]。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織（OIE）發(fā)布的2019版動物疫病通報名錄，ASFV 感染為需通報的動物疫病。我國把ASF劃為一類動物疫病，是采取緊急嚴厲的強制預(yù)防、控制、撲滅的對象。

中國首例ASF病例發(fā)生于2018年8月3日沈陽某養(yǎng)殖戶，存欄豬383頭，47頭發(fā)病并死亡，病料檢測ASFV 核酸陽性。根據(jù)中國動物衛(wèi)生與流行病學中心的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截至2019年3月13日，ASF肆虐中國28個省，發(fā)布疫情113起（其中3起為野豬疫情），此次ASF 疫情對中國整個豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。根據(jù)OIE官網(wǎng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，僅2018年9 月28 日～2019 年3 月1 日，中國因ASFV 感染致死及淘汰的豬只數(shù)量達到257 005頭，ASF在不到一年的時間給中國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

目前，ASFV 感染尚無有效的疫苗，主要通過檢疫、撲殺來控制其暴發(fā)流行。因此，科學有效的檢測診斷方法是防止ASF大范圍暴發(fā)流行的有效手段。以下就ASF的診斷方法予以介紹。

1 ASF病原學及流行病學

1.1 病原學

ASFV 是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬中的唯一成員。ASFV 能在雞胚卵黃囊中培養(yǎng)生長，大多數(shù)毒株能在豬單核細胞、骨髓細胞和白細胞內(nèi)生長。ASFV 基因組為一條雙鏈DNA 分子，170～190 kb（跟豬瘟病毒的基因組12 kb 相比，大小相差15倍），可編碼150～200種蛋白質(zhì)，基因型多達24 個，8 個血清群（ASF 很少產(chǎn)生中和抗體，所以無血清型概念，但可通過紅細胞吸附試驗分成8個血清群），不同血清群之間交叉保護力比較差。病毒變異性強，抗感染機制十分復雜，能誘導易感動物產(chǎn)生高滴度抗體，但該抗體是由非中和抗原激發(fā)，不是中和抗體，不具備免疫保護作用。病毒入侵豬體主要在網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞、單核巨噬細胞以及淋巴細胞中復制，造成細胞凋亡，進而導致機體免疫功能低下或不全，嚴重影響宿主的免疫系統(tǒng)[2]。

ASFV對溫度敏感，55 ℃30 min或60 ℃10 min可滅活。室溫條件下，在糞便中可存活11 d，腐敗血液中15 d；4 ℃條件下，在血液中存活18月；在腌制干火腿中可存活150 d；在冷凍豬肉內(nèi)可存活15周，骨髓中達6個月；在半熟肉以及泔水中也可長時間存活。ASFV 非常穩(wěn)定，對熱、腐敗、酸堿和蛋白酶均具有較高耐受性。ASFV 對乙醚和氯仿等脂溶劑敏感，消毒劑中季銨鹽、碘制劑和苯酚類效果較好，而0.8%NaOH、含2.3%有效氯的次氯酸鹽、0.3%福爾馬林以及3%鄰苯基苯酚均可在30 min內(nèi)將其滅活[3]。

1.2 流行病學

ASFV感染是一種高度接觸性豬傳染病，ASFV是唯一的蟲媒DNA 病毒，軟蜱或非洲鈍緣軟蜱是其主要貯藏宿主和傳播媒介。軟蜱不僅可長期攜帶病毒，也可通過交配和卵傳遞病毒。軟蜱通過叮咬使豬感染，同群豬通過接觸帶毒豬的分泌物、排泄物感染。養(yǎng)豬場的豬主要以染毒的飼料、車輛、清潔工具，以及帶毒的種豬精液等傳播。ASFV 可在豬體外長期存活，所以感染豬的流動是最常見的傳播方式，加之蜱蟲這一流動性媒介，造成ASFV難以根除。

2 ASF臨床癥狀及解剖學診斷

2.1 臨床癥狀

ASFV 臨床癥狀與經(jīng)典豬瘟（CSF）非常相似。最急性病例多在發(fā)病初期突然死亡，癥狀不明顯。急性病例癥狀最為典型：體溫升至40～41 ℃，高熱持續(xù)約4 d，直到死前48 h，體溫下降，同時臨床癥狀直到體溫下降才突顯出來，表現(xiàn)為食欲廢絕，四肢、耳、皮膚發(fā)紺伴有分散性出血，眼、鼻有漿液性或黏液性膿性分泌物，呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能性紊亂，咳嗽，共濟失調(diào)等。有些毒株會引起帶血下痢，嘔吐，病程5～7 d即死亡。耐過豬終生帶毒，但不出現(xiàn)癥狀，變?yōu)殡[形感染，病毒血癥持續(xù)幾個月或幾年，易發(fā)生繼發(fā)性傳染病[4]。

2.2 解剖病理學

同其他出血熱病毒一樣，ASFV 可導致血管內(nèi)皮細胞凋亡，使血管通透性增加，從而引起內(nèi)臟實質(zhì)性器官表面廣泛的出血性病變。急性、亞急性的病變特征為廣泛性出血及淋巴組織破壞引起的出血性漿液性炎。主要侵害脾臟、淋巴結(jié)、心和腎臟等。脾臟異常腫大至原來的200%～300%，色澤變深，質(zhì)脆，出血性梗死，髓質(zhì)區(qū)切面突起；淋巴結(jié)出血，切面呈大理石狀，有血腫樣結(jié)節(jié)；心包積聚大量漿液性液體，心內(nèi)外膜有小點狀、淤斑狀出血；腎臟皮質(zhì)、腎盂的切面也有小點出血；肝臟腫大，表面有點狀出血，肝門淋巴結(jié)出血，呈黑褐色，膽囊水腫[5]。

ASFV 單獨感染的情況下，根據(jù)典型的臨床癥狀和解剖病理變化，可初步判斷結(jié)果，混合感染情況下臨床癥狀和病變出現(xiàn)多樣化，不具典型性，初判較困難。一般來講，ASF的最終確診需依靠實驗室診斷。

3 ASFV的實驗室診斷

3.1 ASFV的實驗室常規(guī)診斷方法

ASFV 的實驗室常規(guī)診斷主要有病原學、血清學方法，以下重點介紹實用性廣的動物接種實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。

3.1.1 動物接種實驗

該方法是OIE推薦的標準診斷方法之一。用疑似ASFV感染的病料直接接種或接觸無特定病原體（SPF）豬，若SFP 豬發(fā)病，則為ASFV 感染，若不發(fā)病，則不是ASFV感染。對動物接種實驗的疑似感染豬，可進行二次接種試驗做進一步診斷。該方法是診斷ASFV感染的金標準之一，具有準確性高，實驗要求不高的優(yōu)點，但是病毒接種后，根 據(jù)接種毒株的不同及病料中病毒含量的不同，SPF豬發(fā)病需要2～7 d，病豬出現(xiàn)典型癥狀需要5～7 d，不適用于ASFV爆發(fā)期的診斷。

3.1.2 ELISA ELISA分為抗原檢測和抗體檢測兩種，其中抗體檢測ELISA（間接ELISA、iELISA）為OIE 國際貿(mào)易指定試驗，《OIE 陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中以全病毒抗原包板，借以吸附血清中的ASFV 抗體，然后以辣根過氧化物酶標記金黃色葡萄球菌蛋白A（HRP-SPA）與ASFV抗體結(jié)合，最后加入底物，陽性樣品有顯色反應(yīng)。美國kernel 公司出品的ASF 抗體試劑盒，基于間接ELISA，能檢測家豬或者野豬的血清中的ASFV 抗體。與OIE 診斷手冊不同的是該酶標板上包被了純化重組ASFVP54 蛋白抗原。ELISA 方法具有操作簡單、重復性好的優(yōu)點，適用于大規(guī)模流行病學普查，不適用于ASFV 感染的爆發(fā)期診斷，診斷結(jié)果還存在假陽性偏高的問題。

3.2 ASFV的實驗室分子病原學診斷

分子病原學診斷是檢測病料中的病原的DNA或者RNA 核酸，主要有聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）和環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）。PCR自1985年發(fā)明以來，經(jīng)過30 多年的發(fā)展完善，已被廣泛用于獸醫(yī)臨床疫病診斷中。PCR無需病毒的分離培養(yǎng)，直接檢測組織或體液中的病毒核酸分子，具有高效、敏感、準確等優(yōu)點。LAMP是2000年建立的，操作簡便，成本低廉，無需特殊儀器設(shè)備（如PCR 儀、電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)等），整個實驗只需恒溫水浴鍋或金屬恒溫儀即可[6]。LAMP 檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒、細菌、寄生蟲等病原的檢測研究。LAMP 是一種嶄新的DNA 擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點，未來有替代PCR 方法的可能性[7]。

3.2.1 ASFV的PCR檢測方法

PCR 是ASFV 主流檢測方法，也是OIE 國際貿(mào)易指定試驗方法。

3.2.1.1 普通PCR檢測方法

曾少靈等提取了ASFV滅活病毒的核酸并建立ASFV 的PCR 檢測方法，根據(jù)VP73 基因設(shè)計引物P1 5'-CCA-TGG-TCA-GCT-TCA-AAC-GTT-3'，P2 5'-ATT-TGC-GCA-CAA-GCG-TTG-T-3'，擴增長度251 bp[8]。該方法與OIE 推薦使用的2 組PCR引物進行比對試驗，結(jié)果表明3組引物的檢測特異性相當，而曾少靈的引物檢測靈敏度至少高出OIE 引物靈敏度的100 倍。崔尚金等建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法，參照ASFV-P54基因設(shè)計引物，擴增出552 bp的目的片段，研究中采用納米金顆粒作為熱導介子，提高了PCR 反應(yīng)效率，減少了非特異性擴增，其敏感性實驗表明：ASFV納米PCR檢測技術(shù)是常規(guī)PCR檢測技術(shù)敏感性的1 000倍，最低核酸拷貝數(shù)檢出量可達10個拷貝[9]。

《SN∕T1559-2010非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》推薦ASFV 的PCR 檢測引物序列為：P1 序列5'-ATGGAT-ACC-GAG-GGA-ATA-GC-3 3'；P2 序 列5'-CTT-ACC-GAT-GAA-AAT-GAT-AC-3'，PCR 反應(yīng)程序中引物50 ℃退火1 min。紫外光源下觀察凝膠，陽性樣本可見約278 bp的條帶。

2018版《OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》推薦ASFV 的PCR 檢測引物序列為：上游引物F 5'-AGT-TAT-GGG-AAA-CCC-GAC-CC-3'，下游引物R 5'-CCC-TGA-ATC-GGA-GCA-TCC-T-3'。PCR反應(yīng)程序中引物62 ℃退火30 s。40個擴增循環(huán)后，瓊脂糖電泳后成像，陽性樣本可見約257 bp的條帶。

3.2.1.2 熒光定量PCR

根據(jù)《SN∕T 1559-2010 非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》以及2018 版《OIE 陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》，推薦ASFV 的熒光定量PCR 檢測引物序列為：P1 序列5'-CTGCT-CATGG-TATCAATCTTATCGA-3'，P2 序 列5'- GATAC-CACAA-GATC（AG）-GCCGT-3'，TaqMan 探針序列：5'-[6-carboxy-fluorescein（FAM）]-CCACG-GGAGG-AATACCAACC-CAGTG-3'-[6-carboxy-tetramethyl-rhodamine（TAMRA）]。40 個 擴 增 循 環(huán) 中，58 ℃退 火1 min。擴增曲線Ct＜40 為ASFV 核酸陽性（當Ct＜30時為核酸強陽性樣本），當Ct＞40時為ASFV核酸陰性。反應(yīng)結(jié)束的混合液也可瓊脂糖凝膠電泳后成像，可見250 bp的條帶。

3.2.2 ASFV的LAMP檢測方法

江彥增等利用ASFV-P72全基因標準質(zhì)粒作為模板建立了ASFV 的LAMP 檢測方法。特異性好，與其他常見豬DNA 病毒無交叉反應(yīng)；敏感性上LAMP 法能檢測到5 個拷貝的模板，而PCR 方法只能檢測到500 個拷貝，LAMP 方法是OIE 推薦PCR方法的100 倍[10]。楊吉飛等針對ASFV 的保守基因VP72建立了ASFV的LAMP檢測方法，特異性和敏感性良好，對非洲豬瘟參考實驗室饋贈的來自14個國家17株ASFV基因組檢測為核酸陽性[11]。該方法可以檢測到2 fg 的重組質(zhì)粒，OIE 參考的PCR 引物可以檢測到0.2 fg 的重組質(zhì)粒，LAMP 的敏感性比PCR的敏感性低10倍。楊吉飛等指出，ASFV感染產(chǎn)生較高的病毒血癥，通常在感染的第二天就能從血液中檢出，10 倍的敏感性差異并不會影響該LAMP 方法在ASFV 中的檢測應(yīng)用。田純見等建立了ASFV 的高保守性DNA 聚合酶G1211R 非結(jié)構(gòu)基因的實時熒光LAMP 檢測方法，該方法以ASFV E70株病毒核酸為模板，特異性良好，檢測靈敏度達到21 pg，優(yōu)于熒光定量PCR方法[12]。在以ASFV Arm07株制備的各種臨床模擬樣品檢測應(yīng)用中，檢出陽性率比熒光定量PCR方法也略高。

4 小 結(jié)

ASFV 感染的實驗室檢測方法還包括免疫組化法、血細胞吸附實驗、熒光抗體實驗（FAT）等。其中免疫組化法對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度；血細胞吸附試驗作為國際上最經(jīng)典方法之一，但由于科學家發(fā)現(xiàn)了不能吸附紅細胞的ASFV，這些毒株能在白細胞培養(yǎng)物內(nèi)產(chǎn)生細胞病變，但沒有紅細胞吸附能力，1964—1974 年，分離的無紅細胞吸附能力的ASFV毒株多達216株；熒光抗體實驗具有快速、經(jīng)濟、敏感性和特異性高等優(yōu)點，但需要專業(yè)試驗人員，同時需要熒光顯微鏡及高質(zhì)量的熒光標記抗體，且對亞急性和慢性型ASFV 的檢測敏感性僅為40%。所以上述3種方法僅作為ASF的輔助診斷[13]。

PCR、LAMP等分子生物學技術(shù)在豬感染ASFV的早期即可檢測到病毒核酸，在ASFV的早期檢測中具有重要作用[14]。其中LAMP方法是比較新的核酸檢測方法，具有操作流程少，設(shè)備要求不高，特異性靈敏度高，結(jié)果肉眼可判定的優(yōu)點，但是，LAMP靈敏度高的同時易導致非特異性擴增或假陽性的擴增。這種非特異性的假陽性反應(yīng)結(jié)果嚴重限制了其推廣應(yīng)用[15-16]。2018版《OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》推薦的方法中，沒有推薦LAMP 方法檢測ASFV，原因可能是LAMP易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

在ASFV臨床診斷時，各類研究機構(gòu)報道的方法很多，各種方法從不同角度都能有效診斷該病，但很多不是屬于基礎(chǔ)性研究，就是對實驗室的條件要求比較高，并不能得到有效的實踐推廣應(yīng)用。相比較之下，核酸的PCR 檢測是無傳染風險的檢測方法，一般具有檢測設(shè)備的單位均具有檢測資質(zhì)，而且檢測耗時短、準確性高。目前，對ASFV感染的分子診斷，《SN∕T 1559-2010 非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》標準和《OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》均有推薦使用的PCR參考方法。

基因芯片技術(shù)（包括傳統(tǒng)的固相芯片和液相芯片）也是一種比較新的核酸檢測技術(shù)，基因芯片技術(shù)的優(yōu)點在于克服了PCR 中的假陽性和假陰性，保證了結(jié)果特異性及準確性，而且可對大樣本數(shù)量進行高效的高通量檢測，可用于疫源群體的個體病毒攜帶情況篩查，做到疫病監(jiān)測預(yù)警，缺點在于技術(shù)要求相對較高[17]。目前，ASFV 感染的基因芯片檢測的研究鮮見，相信通過眾多學者不斷的努力研究，技術(shù)不斷的優(yōu)化，芯片技術(shù)將會在疫病監(jiān)測方面大顯身手。