高效液相色譜法檢測奶牛血清中脂肪酸濃度測定

錢 坤

（天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，天津 300402）

高效液相色譜法是一種科學(xué)有效的檢測方式，在奶牛血清中脂肪酸濃度測定中應(yīng)用效果顯著，可以有效的提升測量的精準(zhǔn)度，解決了氣相色譜法檢測的問題與不足，具有穩(wěn)定高效的特征。

1 高效液相色譜法檢測奶牛血清中脂肪酸濃度測定實(shí)驗(yàn)

奶牛在分娩之前2周直至娩之后的10d左右，血漿中脂肪酸濃度會(huì)呈現(xiàn)一定的波動(dòng)變化，一般會(huì)在平均0.2mmol/L 逐漸增加到0.75mmol/L左右，而患酮病奶牛血液中的脂肪酸濃度則就會(huì)高達(dá)1mmol/L左右。脂肪酸代謝紊亂會(huì)影響奶牛的胰島素抵抗以及細(xì)胞免疫等問題，通過高效液相色譜法進(jìn)行奶牛血清中脂肪酸濃度測定，可以為脂肪酸代謝紊亂的控制提供參考與支持。通過氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸代謝檢測，因?yàn)闇囟雀撸苋菀讓?dǎo)致不飽和脂肪酸在檢測中出現(xiàn)異構(gòu)化的問題，隨著各種技術(shù)手段的成熟，通過HPLC奶牛血清中脂肪酸濃度測定的研究也逐漸增多。

1.1 材料

選擇健康奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物；根據(jù)要求進(jìn)行試劑配制處理。

1.2 血漿脂肪酸提取

將0.25ml血清放入到10ml離心管之中，然后分別添加25μl內(nèi)標(biāo)溶液以及1.25ml提取液，對(duì)其進(jìn)行旋渦處理，時(shí)間為10min；處理之后添加1ml正庚烷、0.75ml水，對(duì)其渦旋處理，時(shí)間為5 min。通過 4500r/min 離心處理 5 min，獲得上層正庚烷溶液，將其放在4ml玻璃瓶之中，在離心管中添加1ml正庚烷，對(duì)其渦旋處理5min，通過4500r/min 離心處理5min，與上層正庚烷溶液進(jìn)行合并，通過氮?dú)膺M(jìn)行吹干獲得樣品小瓶。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取對(duì)照品50μl、100μl、200μl、400μl、800μl工作溶液，將其放在4ml玻璃瓶之中，分別添加25μl的內(nèi)標(biāo)溶液，通過氮?dú)鈱⑵浯蹈桑@得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品小瓶。

1.4 脂肪酸的衍生化

在小瓶中或者標(biāo)準(zhǔn)曲線小瓶中的，加入2-溴苯乙酮丙酮溶液50μl以及三乙胺溶液50μl，通過添加300μl丙酮，要蓋緊螺旋蓋，對(duì)其震蕩處理1min，將其放在95℃的干燥箱中進(jìn)行反應(yīng)，15min之后取出之后將其冷卻；然后添加75μl的醋酸丙酮溶液，將其震蕩1 min之后，將其放在95℃中進(jìn)行干燥箱反應(yīng)處理5 min，然后將其冷卻處理，通過氮?dú)獯蹈商幚恚ㄟ^0.5ml的甲醇復(fù)溶將其進(jìn)行微孔濾膜處理，放置1.5ml的上機(jī)小瓶中進(jìn)行處理。

1.5 精密度試驗(yàn)

取0.25ml的血清進(jìn)行精密量處理，根據(jù)規(guī)范要求進(jìn)行五次處理，計(jì)算分析脂肪酸的濃度，并且計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 加樣回收率試驗(yàn)

取0.25ml血清添加100μl對(duì)照品的工作融合，將其混勻之后，根據(jù)以上方法進(jìn)行三次處理，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各脂肪酸濃度，計(jì)算回收率。

2 奶牛血清中脂肪酸濃度測定結(jié)果

2.1 色譜圖

8種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品均達(dá)到了基線分離。奶牛血清樣品色譜圖中可以發(fā)現(xiàn)在25min以及32min的時(shí)候存在未定義峰，通過推測分析其可能是正-十二烷酸以及亞麻酸。并未檢測到達(dá)奶牛血清的二十二碳六烯酸。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算分析脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物濃度比值、峰面積比值可以發(fā)現(xiàn)二者在線性范圍中的相關(guān)系數(shù)均高于0.999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分析脂肪酸最小定量限為0.01～0.22mg/L；其最小檢測限為0.03～0.67mg/L。

2.3 精密度與回收率

分析精密度以及加樣回收率，通過分析發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)中尚未檢測出C22∶6。而C20∶5的 濃度則小于線性范圍，通過增加取樣量或者降低 C20∶5 的方式進(jìn)行分析，提升檢測精準(zhǔn)性。其精密度RSD≤2.96%，而回收率則主要在 96～99% 區(qū)間范圍中，此種方式精準(zhǔn)、穩(wěn)定。

3 討論分析

3.1 衍生化方法

通過紫外線檢測器進(jìn)行脂肪酸的衍生化反應(yīng)檢測分析。通過2-溴苯乙酮作為主要的衍生化試劑，此種方式操作簡單便捷，其產(chǎn)物相對(duì)較為穩(wěn)定。在60min中則可以完全出峰。在處理中乙腈、丙酮以及正己烷都是性能良好的衍生化反應(yīng)介質(zhì)，而水分則就會(huì)降低反應(yīng)得率，在此次實(shí)驗(yàn)中通過干燥箱加熱的方式進(jìn)行衍生化反應(yīng)處理。

Wood 等學(xué)者明確的指出了如果2-溴苯乙酮過量則就會(huì)導(dǎo)致其與色譜柱中的填料產(chǎn)生作用。一些在其他任何富集在柱之上的帶羧基化合物都會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)，這樣就會(huì)對(duì)色譜峰檢測產(chǎn)生一定干擾處理，為了提升檢測的精準(zhǔn)度。在衍生化處理之后要通過添加醋酸的方式進(jìn)行衍生計(jì)處理，這也是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要參數(shù)。

3.2 檢測波長

通過SPD-16檢測器進(jìn)行光譜掃描功能處理，實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪酸衍生化產(chǎn)業(yè)的光譜掃描，確定其最大的吸收波長委托243.7mm，因此要通過244mm作為檢測的波長。

4 結(jié)語

通過0HPLC 方法進(jìn)行奶牛血清中脂肪酸濃度測定分析，其精密度較高，可以滿足回收率的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求，可以為奶牛血清中脂肪酸含量檢測提供支持。為奶牛脂肪酸紊亂的控制與檢測提供了技術(shù)支持。