關于豬瘟病毒Taqman實時定量RT-PCR檢測方法與臨床應用的探討

馬 蘭

（哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

豬瘟病毒是一種小型單鏈RNA病毒，與牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral dirhea virus，BVDV）及羊邊界病毒（Borger disease virus，BVD）均屬于黃病毒科瘟病毒屬。而近年發(fā)展的實時熒光定量PCR （Real-time fluorescent quantitativePCR）技術(shù)由于快速檢測微量的病毒核酸，可以準確的確定病毒拷貝數(shù)的樣本，操作方便，耗時短，結(jié)果直觀，這么快就被廣泛使用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學領域。本文通過反復試驗，成功建立了一種實時熒光RT-PCR檢測特異性CSFV的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和樣品

從中牧實業(yè)股份有限公司購買豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖呼吸綜合征病毒（PRSV）、豬O型口蹄疫病毒（O-FMDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒II型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）等滅活疫苗，這些滅活疫苗經(jīng)多次凍融處理后，應用RNA/DNA提取。

1.1.2 主要試劑與儀器設備

主要試劑：磁珠法全自動核酸提取試劑盒、世紀元亨豬瘟通用型實時熒光RT-PCR試劑盒；儀器：MagMAXTMExpress核酸提取儀、AB17500實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 模板準備

在MagMAXTMExpress核酸提取儀的幫助下，按照磁珠自動核酸提取試劑盒的說明書提取PPVAPRVAPCV2的DNA和o=fmdvAPRRSVACSFV的RNA。提取的DNA/RNA用于PCR擴增或-20c保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 精密度試驗

精密吸取濃度為1.000mg/mL的CSFV 1uL，作為實驗模板，連續(xù)進樣6次。x軸為CT值，y軸為Rn，用于CSFV實時熒光定量PCR方法的精密度驗證。

1.2.3 準確度試驗

精密量取含有CSFV病毒的樣本和不含CSFV病毒的樣本各6份，每份1μl，濃度為1.000mg/ml，送至具有實時熒光RT-PCR檢測能力的實驗室進行比對檢測。

1.2.4 特異性試驗

以選擇的反應體系和條件為參照，擴增模板中制備的PPV、PRV、PCV2、o-fmdv、PRRSV、CSFV的DNA，并設置陰性對照和陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗

精密度檢測結(jié)果顯示：第一次檢測CT值為23.1、第二次檢測CT值為23.2、第三次檢測CT值為23.3、第四次檢測CT值為23.2、第五次檢測CT值為23.6、第六次檢測CT值為23.5，變異系數(shù)為1.10%。

2.2 準確度試驗

與設計的一組樣本相比，測試結(jié)果基本一致，具有較好的CSFV檢測精度。

2.3 特異性試驗

用本文方法擴增含有CSFV的疫苗時，會出現(xiàn)陽性擴增信號，而PPV、PRV、PCV2、0-fmdv、PRRSV的核酸模板沒有出現(xiàn)陽性擴增，說明該方法具有較好的特異性。

3 討論

對于中國養(yǎng)豬業(yè)而言，CSFV所造成的危害十分嚴重。目前，我國有大量的CSFV疫苗生產(chǎn)企業(yè)，但生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量差異非常明顯，往往出現(xiàn)免疫失敗。此外，CSFV的臨床表現(xiàn)十分復雜，缺乏典型病例。快速、特異、靈敏的分子生物學診斷方法的發(fā)展，有利于CSFV的快速檢測、CSFV病原陽性豬的清除和豬瘟的純化。將樣品中總RNA提取樣品，以樣品中的mRNA為模板。利用0ligo （dT）或隨機引物將逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板將PCR進行擴增，建立和應用豬瘟病毒Taqman實時定量RT-PCR檢測，可以檢測到多種CSFV陽性樣品，但沒有CSFV的其他樣品沒有特異性擴增，準確度和精密度的檢測結(jié)果也是有效的，表明該方法具有較好的特異性、精密度和準確度。

綜上所述，豬瘟病毒Taqman實時定量RT-PCR檢測方法，敏感性.特異性、準確性好，是了解豬瘟病疫情流行狀況的有效手段，有助于更好地控制豬瘟的感染和流行。