膠體金免疫層析法快速定量檢測飼料中黃曲霉毒素B1殘留

李 明 張振宇 柴 磊

（1.濟源市畜產品質量監測檢驗中心，河南濟源 459000；2.焦作市畜產品質量安全監測中心，河南焦作 454001）

黃曲霉毒素B1是迄今為止人類所知的毒性和致癌性最強的物質之一，其急性毒性約為三氧化二砷的68倍、氰化鉀的10倍。隨著飼料工業的快速發展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴重挑戰，為了保證食品安全，保障消費者的健康，需要檢測飼料中黃曲霉毒素B1。目前國內應用標準檢測方法大多為儀器方法，所需儀器設備昂貴，不利于進行廣泛推廣，并且限制了很多檢測單位高效、廣泛地開展檢測工作。膠體金免疫層析法快速定量法檢測飼料中黃曲霉毒素B1殘留具有檢測快速、簡便、靈敏、成本低等優點。

1 材料與方法

1.1 材料

PBS 清洗緩沖液（Charm公司）；AFB1標準液（Romer公司）；AFB1免疫親和柱（Romer公司）；玻璃纖維濾紙（Whatman公司）；ROSA黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測條（Charm公司）。

Waters 2695高效液相色譜儀（Waters公司）；孵育器、讀數儀（Charm公司）。

1.2 快速定量膠體金免疫層析法

準確稱取樣品5.0g試樣于50ml具塞錐形瓶中，加入20ml試樣提取液，密閉，振蕩10min，8000 r/min離心5min，取離心后上清液100μl于另一離心管中，加 入1.0 ml稀釋緩沖液，充分混勻待測。將檢測條平放在分別準確量取300μl待測樣品、陰性質控樣品、陽性質控樣品加入膠體金檢測試紙條的加樣孔中，放入已預熱孵育器中孵育，孵育8 min后取出檢測試紙條觀察C線（質控線）和T線（檢測線）顯色情況。選擇讀數儀調為檢測模式，把檢測條放入讀數儀，讀數儀自動顯示樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

1.3 免疫親和柱凈化HPLC法

稱取樣品4 g于50ml離心管中，加入10ml甲醇，振蕩后靜置20min，渦旋10min。置于5000r/min離心10min，過玻璃纖維濾紙后，取10 ml濾液至離心管，加入40ml PBS緩沖液，免疫親和柱內的液體放棄后，將上述樣液移至50ml注射器筒中，待樣液滴完后，往注射器筒內加入10ml水淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱，在親和柱下放置10ml刻度試管，取下50ml的注射器筒，加入5ml乙腈洗脫親和柱，收集全部洗脫液至刻度試管中。在50℃下氮氣吹至近干，用初始流動相溶解殘留物，0.22μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶，液相色譜進樣分析。

2 結果與分析

2.1 檢測限

取空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補充料樣品各10份，添加濃度為0、2、5、10、20μg/kg，經樣品前處理后進行檢測，結果表明：樣品添加濃度為10μg/kg時，本檢測方法的測定結果均為陽性，因此可以確定該方法檢測限為10μg/kg。

2.2 假陽性率

取空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補充料樣品各10份，5μg/kg AFB1添加濃度，經樣品前處理后進行檢測，統計假陽性數，檢測陰性樣品結果顯示：本檢測方法樣品檢測的假陽性率為0。

2.3 假陰性率

取10μg/kg AFB1添加的豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補充料樣品各10份，20μg/kg AFB1添加各10份，經樣品前處理后進行檢測，檢測陽性樣品結果顯示：本檢測方法對樣品檢測的假陰性率為0。

2.4 特異性

選擇飼料中常檢出的真菌毒素，對空白樣品進行添加測定，通過陰陽性來判斷檢測方法的特異性。在空白豆粕、花生粕、DDGS、奶牛精料補充料樣品中分別添加2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、500μg/kg黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、T-2毒素、伏馬毒素，經樣品前處理后進行檢測，樣品中黃曲霉毒素B1添加濃度≥10μg/kg時，檢測結果呈陽性，其他真菌毒素的檢測結果均為陰性。說明本檢測方法可特異性地檢測黃曲霉毒素B1，而對其他真菌毒素無特異性反應。

2.5 實際樣品檢測中兩種方法比對

抽取花生粕、奶牛精料補充料樣品共20份，用膠體金免疫層析法和儀器方法分別進行檢測。儀器方法參考GB/T 30955-2014《飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定 免疫親和柱凈化-高效液相色譜》，結果表明其中17個樣品呈陰性，兩種方法檢測黃曲霉毒素B1含量均未檢出，另3個樣品呈陽性，兩種方法均有檢出，相對偏差的計算是以高效液相色譜測定值為參考值，兩種方法的最大相對偏差為15.1%，其結果具有一致性。

3 結論

用膠體金免疫層析方法初步篩查飼料原料中黃曲霉毒素B1的方法滿足對黃曲霉毒素B1滿足對黃曲霉毒素B1限量要求。膠體金免疫層析法快速定量法檢測飼料中黃曲霉毒素B1殘留具有檢測快速、簡便、靈敏、成本低等優點，可作為一種快速篩查方法，當篩查出高于檢測限的陽性樣品時，須采用相關液相、液質分析方法進行確證。