Dicer mRNA在肥胖高血壓內臟白色脂肪組織中的表達*

劉紅霞 施 真

濱州醫學院基礎醫學院生理學教研室 煙臺 264003

肥胖是全球性健康問題，嚴重威脅人類身體健康。眾多研究均已證實肥胖和高血壓密切相關[1]。肥胖中腹型肥胖與心血管疾病風險之間的關系尤為顯著[2]，有研究表明內臟脂肪與皮下脂肪比與原發性高血壓具有高相關性[3]。最新研究證實脂肪組織來源的microRNAs (miRNAs)是循環miRNAs的主要來源[4]，而Dicer是miRNAs形成的關鍵酶，在Dicer作用下前小RNA才能成為成熟miRNAs，因此Dicer表達量高低通過影響miRNAs可在多種疾病中發揮重要作用。但內臟脂肪組織中Dicer表達量在肥胖高血壓患者是否異常尚無研究。本研究通過采集臨床腹部擇期手術患者內臟脂肪，檢測其Dicer表達改變，分析其與肥胖高血壓發病之間的關系，為探明肥胖高血壓發病機制，尋找治療靶點提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2014年12月至2018年8月某院收治的314例行擇期腹部手術患者為研究對象，本研究符合作者所在單位人體試驗倫理委員會所制定的倫理學標準，并取得病人的知情同意。年齡38～68周歲，男女不限；高血壓標準為收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg；根據體重指數(Body Mass Index, BMI)分為肥胖和正常體重患者，肥胖BMI≥25 kg/m2，正常體重BMI<25 kg/m2。314例納入研究患者中，>60歲者64例，31～40歲者81例，41～50歲者84例，51～60歲者85例。>60歲64例老年患者中，血壓正常者30例，高血壓患者34例。250例60歲以下患者中，正常體重正常血壓者83例，單純肥胖血壓正常者56例，單純高血壓正常體重者30例，肥胖高血壓患者81例。

1.2 主要儀器與試劑 Trizol購自美國Invitrogen公司；根據NCBI基因庫數據應用在線引物設計軟件primer 5.0設計Dicer和內參GAPDH檢測引物，采用BLAST進行比對，由Invitrogen公司合成。 Dicer正義鏈引物：5′-GTACGACTACCACAAGTACTTC-3′，反義鏈引物：5′-ATAGTACACCTGCCAGACTGT-3′；GAPDH正義鏈引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，反義鏈引物：5′-CCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3′。熒光定量PCR試劑盒購自TransGen Biotech公司,反轉錄試劑盒購自Takara Bio公司。NanoDropND-1000分光光度計測定總RNA和cDNA含量和純度。qRT-PCR儀器為ThermoFisher公司QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 內臟脂肪組織采集 下腹腔內臟周圍新鮮的脂肪組織200 mg，取樣時間控制在10 min以內。剔除結締組織等非研究所需的組織。在RNase-free的0.9%生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和污物。裝入凍存管，旋上蓋子，迅速投入液氮冷卻后將樣品轉移到-80℃保存。

1.3.2 脂肪組織總RNA的提取 每200 mg脂肪組織加1 mL trizol裂解，室溫靜置10 min，加入 0.2 mL氯仿，上下顛倒20 次，靜置 15 min，4℃ 12 000 rpm離心15 min，取上清400～500μL，加入 0.5 mL 異丙醇，上下顛倒20 次，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，棄上清，加入1 mL 75% 冰乙醇，輕輕彈開洗滌沉淀，4 ℃ 7 500 rpm離心5 min，棄上清晾干，加入15 μL Nase Free H2O溶解，Nanodrop測濃度和質量，A280/A260≥1.8者可用于后續實驗。

1.3.3 cDNA合成 根據試劑盒說明首先去除基因組DNA反應，10μL反應體系中包含1μg總RNA，2.0 μL 5 × gDNA Eraser buffer，1.0 μL gDNA Eraser，42 ℃ 2 min 4 ℃離心，加入4.0μL RNase Free H2O，4.0μL 5 × PrimeScriptBuffer2，1.0 μL RT Primer Mix，1.0μL PrimeScript RTEnzyme Mix I配成20 μL反轉錄反應體系，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，4 ℃離心。

1.3.4 熒光定量PCR 根據試劑盒說明，20 μL反應體系為正義鏈和反義鏈引物各0.4 μL(終濃度0.2 μM)，2×TransStar Tip Green qPCR SuperMix (+Dye I/+DyeII) 10 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free H2O 7.2 μL，反應步驟：94 ℃ 30 sec，94 ℃ 5 sec，50～60 ℃ 15 sec， 40個循環，72 ℃ 10 sec后溶解曲線。采用2(-△△CT)相對定量法比較各組差異。

2 結果

2.1 年齡對內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達的影響 如圖1所示，與31～40歲患者(1.00±0.03)相比，41～50歲(1.46±0.34)，51～60歲患者(1.47±0.24)和60歲以上老年人(2.12±0.33)內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)，但41～50歲(1.46±0.34)及51～60歲患者(1.47±0.24)兩組患者之間差異無統計學意義(P>0.05)。與41～50歲患者(1.46 ± 0.34)相比，60歲以上老年人(2.12 ± 0.33)內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。與51～60歲患者(1.47±0.24)相比，60歲以上老年人(2.12±0.33)內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 單純肥胖對內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達的影響 如圖2所示，60歲以下患者中，與正常體重正常血壓者(1.00±0.21)相比，單純肥胖正常血壓患者(0.98±0.11)內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 不同年齡組內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達水平

圖2 非老年單純肥胖內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達水平

2.3 老年高血壓對內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達的影響 如圖3所示，60歲以上患者中，與正常血壓患者(1.00±0.10)相比，高血壓患者(0.79±0.12)內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 肥胖高血壓對內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達的影響 如圖4所示，60歲以下患者中，與正常體重正常血壓者(1.00±0.12)相比，單純高血壓患者(0.85±0.10)和肥胖高血壓患者(0.59±0.06)內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)；且與單純高血壓患者(0.85±0.10)相比，肥胖高血壓患者(0.59±0.06)內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 老年高血壓內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達水平

圖4 非老年高血壓內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達水平

3 討論

本研究發現隨年齡增長，內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達顯著升高，而老年高血壓患者內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達顯著降低；去除年齡因素后，單純肥胖對內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達無顯著影響，而單純高血壓患者內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達顯著降低，肥胖高血壓患者內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達降低更顯著。這些結果表明內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達降低參與多種高血壓，如老年高血壓，尤其是肥胖高血壓的發生、發展。

高血壓是嚴重危害人類健康的常見病，發病率高，且治療效果不夠理想[5-6]，如何有效防治高血壓是醫學界急需攻克的重大醫學難題。肥胖是高血壓的重要易感因素。肥胖的關鍵組織——脂肪組織，一直被認為只有能量儲存和平衡能量代謝的作用。近年來脂肪組織逐漸被認為是內分泌器官之一，其分泌的激素可調控其他組織器官功能，在包括高血壓在內的代謝綜合征中發揮重要作用[7]。另外，眾多研究表明miRNAs在多種疾病[8]，包括心血管疾病發病中發揮重要作用[9]。最新研究結果[10]表明脂肪組織是循環血中microRNAs的主要來源，隨血液循環運輸至其他組織，并調節其他組織基因表達和功能。而Dicer是miRNAs形成的關鍵酶，在Dicer作用下前小RNA才能成為成熟miRNAs，因此Dicer表達量高低通過影響miRNAs可在多種疾病中發揮重要作用。因此本研究選擇內臟白色脂肪組織為研究對象，觀察其中Dicer表達量高低與高血壓的關系。

本研究收集2017年12月至2018年8月某院收治的28例行擇期腹部手術患者內臟白色脂肪組織，并采集患者年齡、身高、體重、血壓指標，經熒光定量PCR檢測內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達量高低。結果發現與正常血壓患者相比，高血壓患者內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達量并無顯著變化，這說明可能存在其他因素與內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達增加相關，從而抵消了高血壓患者Dicer mRNA表達改變。因此本研究分別分析了年齡和肥胖與內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達的關系。首先將正常血壓患者按年齡分為31～40歲、41～50歲、51～60歲及60歲以上四組進行比較，結果發現雖然51～60歲與41～50歲兩組無顯著差異，但均較31～40歲患者內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達顯著升高，且60歲以上患者升高更顯著，這些結果表明，隨年齡增長內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達顯著增加。其次，將正常血壓患者按體重指數分為不肥胖和肥胖兩組，結果發現單純肥胖因素并不影響內臟白色脂肪組織Dicer mRNA表達。

眾所周知，年齡也是高血壓的重要風險因素。隨著年齡的增長，高血壓發病率呈顯著增高趨勢。本研究發現，與60歲以上正常血壓患者相比，60歲以上的高血壓患者內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達顯著下降。這說明內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達下降與老年高血壓有密切關系。而去除年齡因素后，在60歲以下患者中，與正常體重、血壓患者相比，單純高血壓患者內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達量顯著下降。以上結果表明，高血壓患者無論年齡高低，內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達量均顯著下降。另外，去除年齡因素，即在60歲以下患者中，與正常體重、血壓者相比，肥胖高血壓患者內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達顯著降低，且較正常體重高血壓者降低更顯著，這些結果表明去除年齡因素后，內臟白色脂肪組織中的Dicer mRNA表達降低與肥胖高血壓患者更顯著相關。

綜上所述，內臟白色脂肪組織中Dicer mRNA表達降低參與高血壓，尤其是肥胖高血壓的發生、發展，為以后更好的研究肥胖高血壓發病機制奠定了理論基礎。