土茯苓中黃杞苷的提取工藝優化及其含量測定*

欒海云 李淑翠 朱海波 蘭天馳 劉 慧 張樹平

1 濱州醫學院藥學院藥理學教研室 煙臺 264003； 2 濱州醫學院公共衛生與管理學院預防醫學教研室

土茯苓為百合科植物光葉菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥根莖。土茯苓有解毒，除濕，通利關節之功效，用于梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣，筋骨疼痛，濕熱淋濁，帶下，癰腫，瘰疬，疥癬[1-2]。土茯苓含多種化學成分，如糖類、有機酸類、苯丙素類、黃酮及黃酮苷類、甾醇類、皂苷類及揮發油等，其中黃酮及黃酮苷類被認為是最為重要的藥理活性物質，包括黃杞苷、落新婦苷、土茯苓苷、槲皮素、表兒茶精等，黃杞苷在土茯苓中比其他黃酮及黃酮苷類化合物含量相對較高[3-5]。近年研究表明二氫黃酮苷類成分具有抗炎、鎮痛等作用[6-8]，黃杞苷具有抗脂質過氧化作用。因此，本實驗主要針對土茯苓藥材中黃杞苷的提取工藝進行優化，為以黃杞苷作為主要成分的中藥新藥研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 無水乙醇、甲醇均為分析純；乙腈、磷酸均為色譜純；純凈水為娃哈哈純凈水。土茯苓藥材編號及產地見表1。黃杞苷對照品(成都普思生物，批號：PS000468)。

表1 土茯苓樣品信息

1.2 儀器與設備 高效液相色譜儀(Waters，2695)；色譜柱Ultimate?XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；數控KQ-600DE 型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的黃杞苷對照品適量，加色譜甲醇配成每1 mL含20 μg的黃杞苷對照品溶液。

1.3.2 樣品處理 藥材粉碎過40目篩，取0.5 g粉末，置于三角瓶中，加入50 mL甲醇，稱定，超聲45 min。放冷后，稱定重量，用甲醇補齊減失的重量，搖勻，過濾，以續濾液為供試溶液，進樣10 μL。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：Ultimate?XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相: (A∶乙腈，B∶0.1%磷酸)梯度洗脫，洗脫條件見表2；流速為1. 0 mL/min；進樣量10 μL，柱溫為35℃；檢測波長為290 nm。

1.3.4 不同產地土茯苓中黃杞苷含量的測定 本試驗采集了中國湖南、廣西、云南、貴州4個地區以及越南的土茯苓，按2.2處理樣品，按1.3.3 色譜條件，采用外標一點法進行黃杞苷的含量測定。

1.3.5 黃杞苷的提取工藝 精密稱取土茯苓粉末2.0 g，分別用95%、80%和70%的乙醇提取，采用回流提取、常溫超聲波輔助提取和常溫滲漉提取三種方法來提取，提取液減壓濃縮，甲醇溶解，0.45 μm過濾，取續濾液，按1.3.3色譜條件進行黃杞苷的含量測定。

1.3.5.1 常溫超聲波輔助提取黃杞苷 精密稱取土茯苓粉末2.0 g，維持30 ℃，液料比(1∶25)，分別加入70 %、80 %、95%的乙醇，室溫超聲提取1 h，補足失重，搖勻，0.22 μm有機膜過濾，取續濾液，進樣量10 μL，按1.3.3色譜條件進行黃杞苷的含量測定。

1.3.5.2 回流方法提取黃杞苷 精密稱取土茯苓粉末2.0 g，液料比(1∶5)，分別加入70 %、80 %、95%的乙醇，回流1 h，放冷，補足失重，搖勻，0.22 μm有機膜過濾。取續濾液，進樣量10 μL，按1.3.3色譜條件進行黃杞苷的含量測定。

1.3.5.3 常溫滲漉法提取黃杞苷 精密稱取土茯苓粉末2.0 g，加入50 mL不同體積分數的乙醇(70%、80 %、95%)浸泡過夜，滲漉450 mL，乙醇定容至50 mL，搖勻，0.22 μm有機膜過濾。取續濾液，進樣量10 μL，按1.3.3色譜條件進行黃杞苷的含量測定。

2 結果

2.1 提取液中黃杞苷HPLC分析色譜方法，見表2。

表2 提取液中黃杞苷HPLC分析色譜方法

2.2 按1.3.3色譜條件下，對照品及不同產地樣品的HPLC色譜圖見圖1，黃杞苷含量見表3。通過比較不同產地土茯苓中黃杞苷的含量，確認越南產土茯苓中黃杞苷的含量最高為0.0575%。

圖1 不同產地土茯苓中黃杞苷的HPLC色譜圖

表3 不同產地土茯苓中黃杞苷的含量

2.3 按1.3.3色譜條件進行黃杞苷的含量測定，回流提取法、常溫超聲波輔助提取法和常溫滲漉提取法三種提取方法均顯示。70%乙醇作為提取溶劑，黃杞苷的含量最高，分別是0.0602%、0.0684%和0.0379%，常溫超聲波輔助提取法最好，見表4。

表4 不同提取方法土茯苓中黃杞苷的含量

3 討論

本研究通過HPLC法測定不同產地土茯苓中黃杞苷含量，結果發現越南產地的含量最高為0.0575%。以越南產地的土茯苓為原料，研究了不同溶劑、不同提取方法對土茯苓中黃杞苷提取效率的影響。結果顯示，70%乙醇提取率最高，其次是80%乙醇，95%乙醇對其提取率最低，說明黃杞苷的極性比較大，70%濃度的乙醇對黃杞苷具有更好的溶解效果，顯示更高的提取效率。本試驗還同時研究了回流提取、常溫超聲波輔助提取和常溫滲漉提取法對土茯苓中黃杞苷含量的影響，結果發現常溫超聲波輔助提取最高，其次是回流提取法，常溫滲漉提取法含量最低，說明在超聲波輔助下，溶劑穿透能力更強，從藥材中溶出目標成分效率更高。本試驗考查了提取溶劑和提取方法對土茯苓中黃杞苷提取效率的影響，確定了黃杞苷合適的提取溶劑和提取方法，為后續的純化奠定了基礎。