明膠誘導(dǎo)類釉質(zhì)樣氟磷灰石合成及其微觀形貌研究

董志恒 張玉靜 高玉光 王青山 韓曉謙

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科 濱州 256603

牙釉質(zhì)是人體骨質(zhì)中最堅硬的部分，主要由羥基磷灰石的結(jié)晶體和少量的氟磷灰石(Fluorapatite，F(xiàn)A)還有鈉、鉀、鎂的碳酸鹽等化學(xué)成分組成[1]。臨床上常見的疾病如齲壞、磨耗、外傷等可導(dǎo)致不可逆的牙體硬組織缺損，因此恢復(fù)牙齒形態(tài)及功能是口腔科醫(yī)生臨床工作的重要任務(wù)。目前臨床上常用的修復(fù)牙體組織缺損的方法有充填術(shù)、嵌體修復(fù)、冠修復(fù)等，但這些方法均需損傷牙體組織且修復(fù)材料無論在結(jié)構(gòu)、組成還是本身的性質(zhì)上都與牙體組織相差較遠(yuǎn)，因此體外在仿生構(gòu)建類釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)用于修復(fù)牙體硬組織缺損是目前國內(nèi)外研究的熱點問題[2-6]。目前常見的方法有重組釉質(zhì)蛋白[1]、利用表面活性劑[2-3]等方式模擬生物礦化的過程，或利用簡單的化學(xué)合成方法[4]來重建表面釉質(zhì)層，然而這些方法未能成功合成類釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，且由于合成條件苛刻不能適用于臨床。目前有研究已明確仿生礦化是構(gòu)建人工晶體的一種有效方法，本文即利用明膠作為大分子有機基質(zhì)，構(gòu)建類釉質(zhì)樣FA，研究FA晶體在不同反應(yīng)時長下其微觀形態(tài)的變化，預(yù)期合成一種形態(tài)可控，微觀形貌與牙釉質(zhì)具有高度的統(tǒng)一性的晶體，為牙體硬組織缺損修復(fù)提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 FA晶體制備 溶液A: 20 mL去離子水中，加入HEDTA 0.557 g與無水氯化鈣0.222 g，60℃恒溫，磁力攪拌器上攪拌4 h。溶液B: 向溶液A中加入一定量的明膠粉末，靜置1 h，60℃水浴。溶液C:向溶液B中加入Ca∶P∶F=5∶3∶1的NaH2PO4·2H2O 0.187 g，pH值調(diào)至6.5；加入 0.02 M NaF溶液，攪拌3 h，37℃恒溫水浴1周，離心、沖洗3次，60℃烘箱中烘干。

1.2 FA晶體性能表征

1.2.1 顯微結(jié)構(gòu)分析 采用掃描電鏡(SEM)觀察FA晶體1、3、5、7 d的顯微結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.2 物相分析 采用X射線衍射儀觀察其特征性峰。

1.2.3 紅外光譜分析 采用Nicolet Avatar 370型傅立葉變換紅外光譜儀( FTIR)分析晶體化學(xué)構(gòu)成。

1.2.4 能譜分析 采用X光電子能譜(XPS) (VG ESCALAB MKII)檢測樣品中的鈣磷比例及氟含量。

2 結(jié)果

2.1 晶體微觀形貌分析

2.1.1 FA晶體形貌 反應(yīng)1 d，可見球樣結(jié)構(gòu)顆粒聚集，未見晶體形成(圖1a)。反應(yīng)3 d，可見晶體成簇聚集，長的可達(dá)4～6 μm，短的約為2～4 μm，晶體橫截面直徑約400～600 nm(圖1b)。反應(yīng)5 d，可見到長梭形晶體樣結(jié)構(gòu)，且聚的更為緊密，長度增加達(dá)7 μm左右，橫截面直徑有1 μm(圖1c、d)。反應(yīng)7 d，可見更為緊密的成簇聚集的晶體，且高倍鏡下可觀察到長梭形晶體結(jié)構(gòu)是由許多平行排列的小晶體組成(圖1e、f)。

a為反應(yīng)1 d；b為反應(yīng)3 d；c、d為反應(yīng)5 d；e、f為反應(yīng)7 d。

圖1 FA晶體隨反應(yīng)時間延長的SEM照片

2.1.2 明膠基質(zhì)下FA晶體形貌 反應(yīng)3 d，可見溶液中花瓣樣形態(tài)的晶體(圖2a)；反應(yīng)5 d，可見晶體相互聚集融合，形成紡錘狀，晶體長度約為6～8 μm，橫截面直徑約為250 nm六棱柱樣結(jié)構(gòu)(圖2b)；反應(yīng)7 d，逐漸轉(zhuǎn)變成規(guī)則六棱柱晶體結(jié)構(gòu)，其橫截面直徑增加達(dá)到500 nm，長度可達(dá)約9～10 μm(圖2c、d)。

a為反應(yīng)3 d；b為反應(yīng)5 d；c、d為反應(yīng)7 d。

圖2 明膠分子基質(zhì)下FA晶體SEM照片

2.2 XRD分析 XRD結(jié)果顯示：FA晶體在2θ=25.9、28.2、29、32.9、33.5、38.8、40、47.6、49.8、55.2°出現(xiàn)特征峰，未見其他雜質(zhì)的峰位(圖3)。說

a為明膠存在下FA晶體XRD圖像； b為無明膠存在下FA晶體XRD圖像

圖3 FA樣品的XRD圖像

明構(gòu)建材料中含有FA，有明膠存在的FA晶體其特征峰值較密集，寬度變大，半高寬度變小，說明明膠的存在促進FA晶體的成熟，隨著時間延長FA特征峰不斷減弱，說明晶體礦化成核結(jié)束(圖4)。

a為反應(yīng)3 d； b為反應(yīng)5 d； c為反應(yīng)7 d

圖4 不同時間條件下FA樣品的XRD圖像

圖5 FA樣品的FT-IR圖像

2.4 樣品基本元素組成分析 通過XPS提供的數(shù)據(jù)顯示，晶體主要由Ca、P和少量的F元素構(gòu)成，與天然釉質(zhì)組成部分類似(圖6)。在無明膠分子存在的條件下，制備的FA的Ca/P比為1.37，而在明膠存在的條件下制備的FA的Ca/P比值為l.577(表1)。

表1 樣品中元素的百分含量

a 為明膠存在條件下FA晶體XPS圖； b為無明膠條件下FA晶體XPS圖。

圖6 FA樣品的XPS圖譜

3 討論

牙體硬組織缺損是臨床常見病，其主要組成部分牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)一旦破壞不能再生，其礦化過程極其復(fù)雜，在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的調(diào)控作用下礦物質(zhì)定點成核，并有序生長[7-12]，其機理為：細(xì)胞外基質(zhì)蛋白主要為秞原蛋白，其組成結(jié)構(gòu)中含有許多官能團，如：天冬氨酸、谷氨酸等，在釉質(zhì)礦化過程中可以與鈣離子結(jié)合，促使釉質(zhì)不斷成熟[13]。因此本實驗?zāi)M牙釉質(zhì)的礦化過程，采用仿生礦化構(gòu)建FA晶體，預(yù)期達(dá)成牙體硬組織的再礦化，目前釉質(zhì)仿生礦化的方式主要有：共沉淀法、模擬體液礦化法，生物仿生礦化、蛋白誘導(dǎo)礦化法、自組裝技術(shù)等，其中生物仿生礦化最接近天然釉質(zhì)的礦化方式，主要是利用膠原、殼聚糖等大分子有機材料做模板，加入F離子后誘導(dǎo)有機物和無機物的有序聚合，該過程可以自組裝，有序組裝，定點礦化等優(yōu)點，同時保證了FA晶體成核的必要條件，促使FA晶體延C軸生長[14-15]。

明膠是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的主要組成部分，由三條多肽鏈構(gòu)成，其中和骨組織相關(guān)的是Ⅰ型膠原蛋白，其生物相容性良好，穩(wěn)定性好，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的增值和分化，并且可降解。因此被廣泛應(yīng)用與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，明膠分子鏈側(cè)鏈上有許多氨基官能團，能夠在晶體礦化過程中與鈣離子有序結(jié)合，以FA片段為成核中心，球形的小晶體開始在片段的兩端開始聚集生長，從而調(diào)控晶體礦化過程，隨著反應(yīng)時間的延長，鈣離子不斷釋放，合成晶體從開始的成簇聚集變成六棱柱樣結(jié)構(gòu)，沿著晶體的c軸不斷聚集，當(dāng)鈣離子的釋放完全后晶體的礦化結(jié)束，最終在明膠的調(diào)控下生物模擬天然釉質(zhì)的礦化過程，得到與天然釉質(zhì)相近的FA晶體[16]。

XRD測試通常是用來分析晶體的化學(xué)結(jié)構(gòu)的。實驗組與標(biāo)準(zhǔn)的FA晶體結(jié)構(gòu) (JCPDS#15-0876)非常接近，特征峰值表明其組成部分為FA，因此，確定本實驗獲得的類釉質(zhì)樣晶體為FA。這也與掃描電鏡形貌相符，說明在仿生條件下，形成形貌規(guī)則、結(jié)晶性較好的FA納米晶體，較長的反應(yīng)時間是必備條件之一。

FTIR是用來分析有機分子的構(gòu)象及結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的情況，實驗證明明膠分子鏈中含有很多化學(xué)鍵相互作用，有機物和無機物之間有化學(xué)鍵結(jié)合，有較強的分子力作用。

XPS是由材料內(nèi)電子的躍遷產(chǎn)生特征光譜，它與原子序數(shù)一一對應(yīng)的，因此是目前元素分析的主要檢測技術(shù)[16]，實驗顯示構(gòu)建的晶體主要是由Ca、P、F組成，與牙釉質(zhì)組成部分相似，在明膠存在的條件下制備的FA的Ca/P更接近天然釉質(zhì)，F(xiàn)離子占的比例高于天然釉質(zhì)(3.8%)，因此其抗齲能力更強。

綜上所述，通過結(jié)合XPS、XRD和FT-IR顯示的數(shù)據(jù)，表明合成的樣品主要為FA晶體。本文利用生物礦化原理，采用明膠基質(zhì)作為有機大分子模板，仿生構(gòu)建類釉質(zhì)樣FA晶體，并對其反應(yīng)過程及形態(tài)相貌進行了調(diào)控，為人體硬組織缺損修復(fù)提供了理論依據(jù)，但對于其在牙釉質(zhì)表面的生物礦化以及其生物相容性還有待于進一步研究。