淺談洗板對ELISA試驗的影響

2018年11月14日，我中心實驗室進行犬細粒棘球絳蟲糞抗原檢測試驗。試驗由2名實驗員操作，另有3名見習實驗員輔助。犬細粒棘球絳蟲抗原檢測試劑盒（批號：Eg-Ag20180620）由上級單位統一配發。274份犬糞樣品事先經-70℃冷凍一周處理，試驗當日室溫解凍后每份取1 g樣品，加1 ml樣品處理液，4 000 rpm離心15 min待用。試驗用儀器：酶標儀正常，培養箱正常，96孔自動洗板機開機沖洗管路正常。實驗員甲操作A、B兩塊包被板184份樣品的試驗，實驗員乙操作C塊包被板90份樣品的試驗。試驗過程嚴格按著試劑盒說明書逐步進行，洗板過程中習慣性的同一方向放入包被板，合上蓋子洗板，未察覺異常。

試驗結束，結果均成立。但三塊包被板之間出現非常相似的陽性結果，即A、B、C各板的D—12、E—12、G—12三孔均顯陽性（另有A板B—12孔為陽性），且C板G—12孔無樣品仍顯陽性。這樣的結果引起我們的注意，回憶操作過程未出現遺漏、失誤，檢查洗板機發現D—12、E—12、G—12對應的針孔堵塞，不出液體。這樣能解釋為什么不同的人操作不同的反應板出現高度相似的結果，且無樣品孔也出現陽性。

查出問題后，疏通洗板機針孔，隨即對全部樣品按原樣進行復檢，結果為A板B—12孔為陽性，有異議的各板D—12、E—12、G—12三孔均顯陰性（其中C板G—12孔無樣品）。

該試驗由抗細粒棘球絳蟲特異性抗體包被的微孔板和酶標記抗棘球絳蟲特異性抗體，以雙抗體夾心法檢測犬糞便中細粒棘球絳蟲抗原。試驗中，加入待檢樣品，經過溫育后，若樣品中含有細粒棘球絳蟲抗原，則與包被板上的抗體結合，經洗滌后除去未結合的抗原，再加入酶標記物，與包被板上的抗體-抗原復合物結合形成抗體-抗原-酶標記物復合物，經洗滌除去未結合的酶標記物，在微孔中加入顯色液，經酶催化形成的藍色信號與樣品中的抗原含量成正比。

本次試驗中由于洗板機的故障，洗板過程中個別孔洗滌不充分或未得到洗滌，使得微孔中的酶標記物留存，導致加入顯色液后，酶催化底物成為有色產物而最終顯陽性。

洗滌在ELISA試驗過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著試驗的成敗。洗板達到分離游離的和結合的酶標記物的目的，清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質，以供最終檢測。筆者認為在ELISA試驗過程中，洗滌對試驗的影響主要有以下幾點（除去本次試驗中洗板機針孔堵塞情況）。

一、注液量

如果試驗結果出現較多的假陽性，可以懷疑是洗板未洗干凈造成的，那么就需要將注液量調大，最好是注滿整個孔。注液量太少洗不到微孔較高的位置，而這些位置可能也有殘留的待檢測物質，從而使最終結果出現假陽性。ELISA微孔板的廠家一般會在試劑盒的說明書中寫明建議使用的注液量（300 μl）。一般來說，注液量越大，則殘留的抗體或抗原量就越少。增大注液量最直接的方法是注入過量的洗滌液，現有先進的洗板機會有防溢液功能，當注液過量時多余洗液會自動被吸走，不會流到板架和儀器內。

二、洗板次數和洗板強度

第二個影響洗滌效果的主要參數是洗板次數和洗板強度。洗板次數越多，洗板強度越大，殘留量也就越低。但是洗板次數過多或洗板強度過大可能會破壞已包被的固相載體，反而使檢測結果不準確。有時候也會遇到一些特殊情況的試劑，比如游離的物質吸附性較強，較難洗凈，這時就需要增大洗板強度或洗板次數；或者恰恰相反，參與結合的固相載體不是特別牢固，容易被沖洗掉，這時就需要減弱洗板強度或減少洗板次數。通常ELISA微孔板的廠家也會在說明書中注明建議的洗板次數。

三、吸液高度和吸液位置

最后一個影響洗板效果的參數就是吸液高度和吸液位置，吸液高度會明顯影響殘留量，如果吸頭與反應孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加。反之，如果吸頭壓著反應孔底部，液體比較難進入吸頭，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加。大多數洗板機會使用浮動的洗板頭，這種洗板頭有一定的自由調節空間，下降到微孔底部，接觸后會自然頂起一部分，不需要根據不同的微孔板設置不同的吸液高度，而是直接下降到微孔底部進行吸液。

吸液的位置也對殘留量有著重要影響。如果每個孔只使用一個抽吸點，也就是一點吸液，那么吸液的位置是非常重要的。這個位置最好設置在微孔的中間位置，這樣整個孔中的液體抽吸過程比較均勻。還有的廠家設置為兩點吸液，就是在孔中心與孔壁之間的某處取前后兩點進行吸液，使殘留量降到最小。

本次試驗由于人員的疏忽導致出現假陽性的結果，也警示實驗室人員在實驗過程中對于每一步都要嚴謹、細致。并且在洗板過程中不要隨意更改說明書中建議的洗板參數。