超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和膠體金快速定量法測定牛奶中黃曲霉毒素M1比較

張振宇 柴 磊 李 明

（1.濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南濟(jì)源 459000；2.焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，河南焦作 454001）

1 前言

黃曲霉毒素M1（AFM1）是由常見的黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。哺乳類動(dòng)物攝入被AFB1污染的飼料后，在體內(nèi)羥基衍生轉(zhuǎn)化成AFM1。AFM1的危害主要表現(xiàn)在致癌性和致突變性，對人及動(dòng)物肝臟組織有破壞作用，可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。

牛奶中的黃曲霉毒素主要來源于飼料。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物。我國規(guī)定牛奶中黃曲霉毒素 M1含量不得超過0.5 μg/kg。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

PBS 清洗緩沖液（Charm公司）；AFM1、AFM1-13C17標(biāo)準(zhǔn)液（Romer公司）；AFM1免疫親和柱（Romer公司）；玻璃纖維濾紙（Whatman公司）；ROSA黃曲霉毒素M1膠體金快速定量檢測條（Charm公司，檢測限0.5μg/kg）。

UPLC-Xevo TQ MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters公司）；孵育器、讀數(shù)儀（Charm公司）。

2.2 方法

2.2.1 免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

（1）樣品前處理

牛奶中的黃曲霉毒素M1含量測定一般按照GB 5009.24-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素M族的測定》第一法 同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定。

（2）液相色譜條件

色譜柱：CORTECS UPLC C18 Column，（1.6 μm，2.1 mm X 100 mm）；流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為0.2%甲酸水梯度洗脫；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為5μl。

（3）質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式采集；毛細(xì)管電壓2.7kV離子源溫度為150℃；脫溶劑氣溫度為500℃；脫溶劑氣流量為1000L/h。

2.2.2 膠體金快速定量法

分別準(zhǔn)確量取300μl待測樣品、陰性質(zhì)控樣品、陽性質(zhì)控樣品加入膠體金檢測試紙條的加樣孔中，放入已預(yù)熱孵育器中孵育，孵育8 min后取出檢測試紙條觀察C線（質(zhì)控線）和T線（檢測線）顯色情況。選擇讀數(shù)儀調(diào)為檢測模式，把檢測條放入讀數(shù)儀，讀數(shù)儀自動(dòng)顯示樣品中黃曲霉毒素M1的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩種方法的精準(zhǔn)性

空白樣品中分別添加黃曲霉毒素M1為0.5，1.0，2.0μg/kg濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別用免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和膠體金快速定量法檢測，取6次平行測定結(jié)果，計(jì)算方法的精密度。

用免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測3個(gè)水平添加黃曲霉毒素M16次重復(fù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%，用膠體金快速定量法檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.3%，可見用免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測黃曲霉毒素M1含量的精密度更好。

3.2 牛奶樣品黃曲霉毒素M1含量兩個(gè)測定方法的對比試驗(yàn)結(jié)果

抽取20個(gè)牛奶樣品，其中10個(gè)牛奶樣品為陽性添加，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和膠體金快速定量法進(jìn)行黃曲霉毒素M1檢測，結(jié)果表明其中10個(gè)牛奶樣品呈陰性，兩種方法檢測黃曲霉毒素M1含量均未檢出，另10個(gè)牛奶樣品呈陽性，兩種方法均有檢出，相對偏差的計(jì)算是以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定值為參考值，兩種方法的最大相對偏差為10.3%，兩組測定結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)0.99，故其相關(guān)性顯著。

3.3 兩種檢測方法的比較分析

從測定原理來看，免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是用提取液提取試樣中的黃曲霉毒素M1，經(jīng)免疫親和柱凈化，用黃曲霉毒素M1氘代內(nèi)標(biāo)定量，該方法準(zhǔn)確度、靈敏度高、精密度好。膠體金快速定量法是跟據(jù)試樣中黃曲霉毒素M1與膠體金微粒發(fā)生呈色反應(yīng)，讀數(shù)儀檢測條顏色深淺算出黃曲霉毒素M1含量，該方法檢測結(jié)果與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相關(guān)性好，精密度較低、只能簡單定量。

從檢測步驟來看，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃曲霉毒素M1含量時(shí)需要對樣品進(jìn)行稱量、提取、凈化、洗脫、進(jìn)樣上機(jī)測定，其操作過程較為復(fù)雜，檢測時(shí)間較長，檢測費(fèi)用高。膠體金快速定量法只需對樣品簡單操作，就可進(jìn)行測定，操作過程簡單，引起的隨機(jī)誤差小，測定1個(gè)樣品時(shí)間只需10 min，快速簡便，適用于現(xiàn)場快速檢驗(yàn)，可用于奶牛養(yǎng)殖場、生鮮乳收購站、乳品加工車間大量樣品快速篩查。

4 結(jié)論

免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和膠體金快速定量法來測定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量，并對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行分析。免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，膠體金快速定量法能對樣品中的黃曲霉毒素M1進(jìn)行定量，檢測結(jié)果與免疫親和層析凈化超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相關(guān)性好，適用于樣品的快速篩查。