利用均勻設計法優化雞母種培養基*

袁征超，薛玲娜，蘇楚亮，楊昱儀，盧 意，莫美華

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

1 材料與方法

1.1 供試菌種

1.2 PDA培養基制備

選取馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，再加15 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后于121℃滅菌20 min，取出冷卻后貯存備用。

1.3 菌種活化

1.4 均勻設計試驗法

1.4.1 可溶性碳酸鈣清液制備

稱取10 g可溶性輕質碳酸鈣，溶于1 L水中，攪拌溶解靜置10 min后，取上層清液，添加相應量到相應的試驗組中。

1.4.2 蟻穴浸提物的制備

1.4.3 均勻設計試驗

（1）均勻設計試驗方案的制定

根據單因素試驗結果，選取對雞樅菌絲生長較好的碳源、氮源、氨基酸、維生素、無機鹽、蟻穴物、抑菌劑，如馬鈴薯汁、麥芽糖、酵母膏、VB9、脯氨酸、碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蟻穴浸提物、鏈霉素10個因素作為均勻設計的參試因子，每因子設12個水平，見表1[8-9]，采用10因素12水平的均勻設計表U1（2121）0進行試驗設計，見表2，得出雞菌母種培養基優化方案，見表3。按照表3的試驗方案配制母種培養基，在121℃滅菌30 min，倒于平板，冷卻凝固后，接入準備好的菌種圓片，倒置于26℃恒溫生化培養箱中避光培養。

（2）各組分的添加方式

馬鈴薯汁、麥芽糖、酵母膏、可溶性碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蟻穴浸提物配成母種培養基的主液，121℃高壓蒸汽滅菌30 min；VB9、脯氨酸、鏈霉素3種熱敏性的組分通過濾徑為0.22μm無菌脂溶性濾膜過濾后，添加到培養基主液中。

表1 參試因子水平表Tab.1 List with regard to all relative parameters

試驗號 列號1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 2 3 4 5 6 8 9 10 12 2 2 4 6 8 10 12 3 5 7 11 3 9 12 2 5 11 1 4 10 4 4 8 12 3 7 11 6 10 1 9 3 6 5 5 10 2 7 12 4 1 6 11 8 6 6 12 5 11 4 10 9 2 8 7 7 7 1 8 2 9 3 4 11 5 6 8 3 11 6 1 9 12 7 2 5 9 9 5 1 10 6 2 7 3 12 4 8 10 10 7 4 1 11 8 2 12 9 3 11 11 9 7 5 3 1 10 8 6 2 12 12 11 10 9 8 7 5 4 3 1

試驗組X2X3X4X5X6X7X8X9X10/（mg·L-1）1 0 2.0 1.0 60.0 80.0 5.0 7.0 8.0 180.0 22.0 2 20.0 6.0 2.5 140.0 180.0 11.0 2.0 4.0 120.0 20.0 3 40.0 10.0 4.0 220.0 20.0 4.0 10.0 0.0 60.0 18.0 4 60.0 14.0 5.5 40.0 120.0 10.0 5.0 9.0 0 16.0 5 80.0 18.0 0.5 120.0 220.0 3.0 0.0 5.0 200.0 14.0 6 100.0 22.0 2.0 200.0 60.0 9.0 8.0 1.0 140.0 12.0 7 120.0 0 3.5 20.0 100.0 2.0 3.0 10.0 80.0 10.0 8 140.0 4.0 5.0 100.0 0 8.0 11.0 6.0 20.0 8.0 9 160.0 8.0 0 180.0 100.0 1.0 6.0 2.0 220.0 6.0 10 180.0 12.0 1.5 0 200.0 7.0 1.0 11.0 160.0 4.0 11 200.0 16.0 3.0 80.0 40.0 0 9.0 7.0 100.0 2.0 12 220.0 20.0 4.5 160.0 140.0 6.0 4.0 3.0 40.0 0各參試因子用量X1/（mL·L-1）/（g·L-1）/（g·L-1）/（μg·L-1）/（μg·L-1）/（mL·L-1）/（g·L-1）/（g·L-1）/（mL·L-1）

（3） 接種培養

在超凈工作臺的無菌環境下，將制備好的直徑為0.35 cm的雞菌菌種圓片，接入到相應的培養基平板中。將接種好的平板倒置，于26℃恒溫生化培養箱中避光培養。

1.5 數據統計與分析方法

所有實驗均設3個重復，采用DPSv9.5數據處理軟件進行數據分析和數據處理。采用Duncan新復極差法進行多重比較。對均勻設計的試驗結果使用二次多項式回歸分析方法，然后通過數學模型模擬獲得最優配方。

2 結果與分析

2.1 均勻設計試驗優化結果

均勻設計試驗結果見表4。

試驗結果的指標為菌絲生長速度、菌絲潔白度和菌絲密度[10]。以菌絲生長速度為目標函數（Y），用DPSv9.5對數據進行二次多項式逐步回歸分析，所得回歸方程為：

表4 雞菌母種培養基優化均勻設計試驗結果Tab.4 Results of the experiments above by using orthogonal devices

表4 雞菌母種培養基優化均勻設計試驗結果Tab.4 Results of the experiments above by using orthogonal devices

注：“*”越多說明菌絲越潔白；“＋”越多說明菌絲生長密度越濃厚。Notes：The more*means more dense mass of mycelia，the more＋means more witness mass of mycelia.

試驗組 生長速度/（mm·d-1） 潔白度 菌絲密度11 1.4095±0.0244a *** ＋＋＋10 1.2548±0.0206b **** ＋＋＋＋5 1.2452±0.0012bc *** ＋＋＋6 1.2131±0.0239bcd ** ＋＋12 1.2071±0.0126bcd ** ＋＋9 1.1952±0.0131cd **** ＋＋＋＋2 1.1857±0.0186d * ＋4 1.1690±0.0160d ** ＋＋＋3 1.1048±0.0131e ** ＋＋7 1.0524±0.0113f ** ＋8 0.9583±0.0131g * ＋＋1 0.9048±0.0121h * ＋

對回歸方程進行檢驗，得到復相關系數R=0.999977，由此可見，菌絲生長速度與回歸方程中試驗因素的含量有密切的相關性，其顯著性檢驗值F值=4 752.0164，顯著水平P值=0.0002＜0.01，剩余標準差SSE=0.0022，調整相關系數Ra=0.999871，回歸方程極顯著，說明方程的可信度高。

方程中各項試驗因子的回歸系數和t檢驗結果見表5。

表5 各回歸項的回歸系數檢驗Tab.5 Regression coefficient test of each regression item

由表5可知，方程中有X1（馬鈴薯汁） 與X2（麥芽糖）、X1（馬鈴薯汁） 與X7（磷酸二氫鉀）、X2（麥芽糖） 與X6（碳酸鈣清液）、X4（VB）9與X8（硫酸鎂）、X6（碳酸鈣清液） 與X7（磷酸二氫鉀） 共5組的交互作用顯著水平小于0.01，說明馬鈴薯汁和麥芽糖、馬鈴薯汁和磷酸二氫鉀、麥芽糖和碳酸鈣清液、VB9和硫酸鎂、碳酸鈣清液和磷酸二氫鉀等的交互作用對菌絲生長速度影響很大，達到極顯著水平。麥芽糖、碳酸鈣清液對雞菌菌絲的生長達到顯著水平。雞菌母種培養基優化均勻設計試驗結果見圖1。

圖1 雞菌母種培養基優化均勻設計試驗結果Fig.1 Results of the optimum uniform design of stock culture medium of Termitomyces spp.

結合圖1和表4可以看出，得出試驗組11的菌絲生長速度最快，該條件對菌絲的促生長作用效果明顯，同時菌絲潔白度和菌絲密度兩個指標的相對值也較好，該組直觀表現最優；而試驗組10和試驗組9中，菌絲潔白度和菌絲密度兩指標明顯，但試驗組9的菌絲生長速度較試驗組10要慢，因此若針對菌絲潔白度和菌絲密度的高效培養，可以選擇試驗組10。樣本的觀察值、擬合值和擬合誤差見表6。

根據表6數據顯示，觀察值與擬合值接近，最大擬合誤差絕對值僅為0.0018，進一步說明了回歸方程的準確性。

2.2 均勻設計試驗結果的驗證

通過DPSv9.50進行回歸分析，并通過數學模型模擬得到雞母種培養基的理論最優組合如表7所示，將其與組間最優配方11、配方10和真菌通用培養基PDA進行對比培養的驗證實驗，結果如表8所示。

結合表8和圖2可知，在理論最優配方和配方11的培養基中，雞菌絲生長速度最快，且兩者差異不顯著，配方10與配方11相比菌絲的生長速度差異也不顯著，在PDA上的生長速度最慢，且與其他配方存在顯著差異（P＜0.05）。因此，雞菌菌絲生長最快的母種培養基理論最優組，具體配方為馬鈴薯汁 126.20 mL·L-1、麥芽糖 11.63 g·L-1、酵母膏5.50 g·L-1、VB947.90 μg·L-1、脯氨酸 23.37 μg·L-1、可溶性碳酸鈣清液0、磷酸二氫鉀0.07 g·L-1、硫酸鎂 4.19 g·L-1、蟻穴浸提物 61.82 mL·L-1、鏈霉素2.33 mg·L-1。

表6 試驗組的觀察值、擬合值和擬合誤差Tab.6 Observed value，fitted value and fitted error of the samples

2.3培養基中硫酸鎂（X） 8與生長速度關系

培養基中硫酸鎂（X）8與生長速度關系見圖3。

表7 驗證試驗的培養基Tab.7 The medium of the control experiments

表8 驗證試驗的結果Tab.8 Results of the control experiments

圖2 雞菌培養基的對照試驗結果Fig.2 Results of the control experiments of medium of Termitomyces spp.

3 結論

圖3硫酸鎂（X8）與生長速度關系Fig.3 Effect of magnesium sulfate （X8） on the mycelial growth rate

從均勻設計優化結果可以看出理論最優配方和配方11的生長速度最快，兩者間無顯著差異（P＜0.05），兩者的菌絲潔白度、菌絲密度間也無顯著差異；雖然配方10的生長速度比理論最優配方慢，且兩者間差異顯著，但是配方10的菌絲潔白度、菌絲密度均優于理論最優配方和配方11。因此確定雞菌母種培養基生長速度最優配方為：馬鈴薯汁 126.20 mL·L-1、麥芽糖 11.63 g·L-1、酵母膏 5.50 g·L-1、VB947.90 μg·L-1、脯氨酸 23.37 μg·L-1、可溶性碳酸鈣清液0、磷酸二氫鉀0.07 g·L-1、硫酸鎂4.19 g·L-1、蟻穴浸提物 61.82 mL·L-1、鏈霉素 2.33 mg·L-1。菌絲生長最濃密的配方為：馬鈴薯汁180.00 mL·L-1、麥芽糖 12.00 g·L-1、酵母膏 1.50 g·L-1、VB90、脯氨酸200.00μg·L-1、可溶性碳酸鈣清液7.00 mL·L-1、磷酸二氫鉀 1.00 g·L-1、硫酸鎂 11.00 g·L-1、蟻穴浸提物 160.00 mL·L-1、鏈霉素 4.00 mg·L-1。