低溫發酵和冷凍過濾瓢兒酒的工藝優化

王千存，彭 濤*，路宏科，張小燕，張 輝，韓 睿，程天博

（1.甘肅省輕工研究院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅紫軒酒業有限公司，甘肅 嘉峪關 735100）

瓢兒，學名菠蘿莓（pineberry），與草莓味道、外形十分相似，只有櫻桃般大小[1]，白色果肉上點綴棕紅色芝麻狀小紅點，果體僅有人工栽培草莓的十分之一，生長區多分布在陜南淺山陰涼地帶[2-3]。

瓢兒滋味鮮美，酸中帶甜，甜中帶酸，營養豐富，鮮果肉中含維生素C（vitamin C，VC）60～100 mg/100 g，并含有大量的糖類、蛋白質、有機酸、果膠等營養物質，此外還含有豐富的維生素B1、B2以及鈣、磷、鐵、鉀、鋅、鉻等人體所必需的礦物質和部分微量元素[4-5]。

甘肅省宕昌縣瓢兒栽培歷史悠久，適應性強，營養、綠色、無污染，已成為全省乃至全國獨一無二的地方特色果品之一。但由于瓢兒采收期集中，保存期短，主要作為鮮食水果在當地及周邊地區出售，瓢兒資源未被有效地開發利用[6]。瓢兒是熱敏性水果原料，采用傳統熱加工過程極易使其特征香氣成分發生劣變[7]。目前，國內外關于葡萄酒的釀造工藝的研究報道較多，草莓酒釀造工藝研究尚不深入。趙方[8]研究了安琪葡萄酒活性干酵母在草莓汁中的發酵條件，表明發酵溫度為20℃，初始pH值為3.3，接種量為0.2‰，SO2添加量為100 mg/L，果膠酶量添加量為0.3 g/L時發酵出的酒質較好；韓艷秋等[9]以速凍草莓為原料，通過對原料的前處理方式、發酵菌種及接種量、發酵溫度、糖度、偏亞硫酸鉀（K2S2O5）添加量、發酵周期等因素對草莓酒品質影響的研究，確定了最佳發酵工藝參數；劉國明等[10]以草莓為原料，分別加入10種不同酵母進行草莓酒發酵，篩選出了發酵草莓酒感官得分相對較高的3種酵母：酵母F10、帝伯仕果酒專用酵母（紅）、Lalvin D254酵母，并在此基礎上，以果酒感官評分為評價指標，正交試驗優化草莓酒發酵工藝。

低溫發酵技術是通過降低果酒發酵溫度延長發酵時間[11-12]，使酒精發酵過程平緩穩定進行，使瓢兒中的糖分轉化更加完全，充分提取瓢兒中的各類功能性因子和營養成分，最大程度地保瓢兒清香典雅的果香，使各種雜菌對瓢兒酒可能帶來的干擾和影響降到最低。冷凍過濾技術是通過冷凍把酒體溫度降低，再利用硅藻土作為過濾介質經過粗濾、精濾除去果酒中的雜質，減少常溫過濾時果酒香氣物質的揮發，更持久地保留果酒的香味。

本試驗在采用國內傳統果酒加工技術基礎上，融入低溫發酵技術和冷凍過濾技術相結合工藝，以最大限度保留熱敏性原料瓢兒的感官品質和營養成分為著眼點，進行新產品瓢兒酒的研制，為瓢兒的產業化深加工奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓢兒：甘肅省宕昌縣官鵝溝風景區；VC（分析純）：河南青甲貿易有限公司；果膠酶（酶活20 000 U/g）：山東匯益生物科技有限公司；白砂糖（食品級）：蘭州市周邊地區；釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；明膠（食品級）：上海甘源實業有限公司；單寧（食品級）：武漢康益和食品原料有限公司。

1.2 儀器與設備

WZS-1型糖度儀：浙江托普儀器有限公司；PHS-2C型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；酒精計：上海華辰醫用儀表有限公司；PYXDHS-50型恒溫培養箱：上海躍進醫療器械廠；GR11DR立式自動壓力蒸汽滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司AR2140型電子分析天平：奧豪斯國際貿易有限公司；NR60CP多功能色差儀：深圳市三恩時科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 瓢兒酒加工工藝流程及操作要點

操作要點：

原料預處理：挑選成熟、無病害的新鮮瓢兒，除去果梗洗凈果實表面的雜質。

榨汁：瀝干水分后瓢兒放入組織破碎機中破碎，破碎過程中采用流加的方式向瓢兒漿中加入抗壞血酸護色，添加量為0.2 g/kg。

超高壓酶解：瓢兒漿中按果肉量0.01%～0.05%配比添加果膠酶，攪拌均勻后裝入聚丙烯薄膜袋中，用真空包裝機封口，置于超高壓設備的壓力腔內，選擇壓力為100～200 MPa酶解2～4 h。

滅酶：酶解結束后，將壓力升至300 MPa，保壓10 min，滅酶。

成分調整：經超高壓酶解后的瓢兒漿，調整糖度至20～24 °Bx，調整pH至3.3～3.9。

釀酒酵母活化：將釀酒活性干酵母用10倍水溶解，在30～35℃條件下活化20 min，加入到少量瓢兒原漿中活化20 min，冷卻備用。

釀酒酵母接種：將活化后的釀酒酵母加入瓢兒漿中進行無菌接種，接種量為原漿量的3%。

低溫發酵：發酵溫度控制在13～18℃，定期測定發酵液中總糖和酒精含量，原漿發酵至總糖＜4 g/L時結束發酵，然后進行壓榨分離，將自流汁與壓榨汁分別存放，待降溫靜置7 d后，將二者混合得到瓢兒原酒。

澄清處理：在原酒中添加0.03%的明膠與0.06%的單寧，使原酒中不穩定物質沉淀。

冷凍過濾：將澄清處理后的原酒在-10～-5℃條件下存放7 d，在保持原酒溫度-5℃左右過濾。

復配陳釀：對原酒的酒精度和糖度進行調整后靜置陳釀，陳釀溫度保持在13～15℃；復配陳釀后的原酒在-10～-5℃條件下存放7 d。

冷凍精濾：溫度保持在-5℃左右冷凍精濾，即得瓢兒酒。

1.3.2 瓢兒酒的發酵工藝條件優化

（1）單因素試驗

以感官評分為評價指標，分別考察發酵溫度（11℃、13℃、15℃、17℃、19℃、21℃），發酵液糖度（16°Bx、18°Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx）及發酵初始pH值（2.7、3.1、3.5、3.9、4.4、4.9）對瓢兒酒感官品質的影響。

（2）響應面試驗

選取發酵溫度（A）、發酵液糖度（B）、發酵初始pH（C）3個因素進行響應面分析，確定最佳發酵工藝參數，響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.3 瓢兒酒感官、理化及微生物評價方法

（1）瓢兒酒感官評價方法

對瓢兒酒的色澤、香氣、口感和后味等感官特性進行綜合評價，評分方法及依據綜合參考國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，評價（總分100分）標準見表2。

表2 瓢兒酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of pineberry wine

（2）瓢兒酒理化及微生物檢驗方法[13-15]

瓢兒酒理化指標和微生物指標測定依據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的測定項目和檢測方法進行檢驗。瓢兒酒色澤分析：用色差儀測定L*值、a*值、b*值、E*值，其中L*值代表亮度，a*值表征紅綠色，b*值表征黃藍色，E*值代表色度，色差值ΔE表示瓢兒酒顏色變化。當ΔE＞2時，表示樣品的色澤變化明顯，ΔE越大，表示顏色變化越明顯。

1.3.4 冷凍過濾澄清瓢兒酒對其色澤和VC含量的影響

用冷凍過濾澄清瓢兒酒，與傳統過濾方法相比，能降低產品的香氣、色澤和營養物質的損耗。控制過濾溫度分別為-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃時，考察過濾溫度對瓢兒酒色澤及VC含量的影響。

2 結果與分析

2.1 瓢兒酒低溫發酵的單因素試驗

2.1.1 發酵溫度對瓢兒酒感官品質的影響

由圖1可知，隨著發酵溫度在11～15℃范圍內升高，瓢兒酒的感官品質有所提升；當發酵溫度為15℃時，發酵所得瓢兒酒感官品質最佳，感官評分為80.4分；當發酵溫度＞15℃之后，隨著發酵溫度的升高，瓢兒酒的感官品質下降。因此，最適發酵溫度為15℃。

圖1 發酵溫度對瓢兒酒感官品質的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on sensory quality of pineberry wine

2.1.2 發酵液糖度對瓢兒酒品質影響

圖2 發酵液糖度對瓢兒酒感官品質的影響Fig.2 Effect of sugar content of fermentation liquid on sensory quality of pineberry wine

由圖2可知，隨著發酵液糖度在16～20°Bx范圍內升高，瓢兒酒的感官品質有所提升；當發酵液糖度為20°Bx時，發酵所得瓢兒酒感官品質最佳，感官評分為76.4分；當發酵液糖度＞20°Bx之后，隨著發酵液糖度的升高，瓢兒酒的感官品質下降。因此，最適發酵液糖度為20°Bx。

2.1.3 發酵初始pH值對瓢兒酒品質影響

由圖3可知，隨著發酵初始pH值在2.7～3.5范圍內升高，瓢兒酒的感官品質有所提升，當發酵初始pH值為3.5時，感官評分為76.4分，發酵所得瓢兒酒品質最佳；當發酵初始pH值在3.5之后，隨著發酵pH的升高，瓢兒酒的品質下降。因此，最適發酵初始pH值為3.5。

圖3 發酵初始pH值對瓢兒酒感官品質的影響Fig.3 Effect of initial fermentation pH value on sensory quality of pineberry wine

2.2 響應面法優化瓢兒酒低溫發酵工藝

2.2.1 響應面試驗設計方案及結果

以瓢兒酒的感官評分（Y）為響應值，選取發酵溫度（A）、發酵液糖度（B）、發酵初始pH（C）3個因素，采用響應面試驗優化瓢兒酒低溫發酵的最佳工藝條件，結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Design and results of response surface experiments

續表

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗

試驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件的方差分析（analysis of variance，ANOVA）程序，進行二次回歸擬合分析，得到瓢兒酒綜合感官指標值的變化對發酵溫度（A）、發酵液糖度（B）以及發酵初始pH值（C）的數學模型，并對模型進行方差分析，結果見表4，對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到多項回歸方程：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極顯著（P＜0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.993 3），表明所建立的模型可以用來解釋99.33%的響應變化；模型調整確定系數為0.984 8，說明該模型能解釋98.48%響應值的變化，只有1.52%的總變異沒有包括其中，擬合程度較好，失擬不顯著（P＞0.05），說明本試驗所得二次回歸方程高度顯著，能夠很好地對響應值進行預測。交互項AC、二次項A2、C2對瓢兒酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01）；二次項B2對瓢兒酒感官評分的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.3 瓢兒酒發酵響應面分析及優化

根據回歸方程，得到各因素交互作用對瓢兒酒感官評價值影響的響應面圖和等高線圖見圖4，其中等高線圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓表示兩交互作用顯著。

圖4 發酵溫度、糖度及初始pH值交互作用對瓢兒酒感官評分影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,sugar content and initial pH value on sensory evaluation score of pineberry wine

利用Design-Expert軟件分析得到最優發酵條件[16-18]，當發酵溫度為15.64℃、糖度為21.53°Bx、初始pH值為3.48時，瓢兒酒感官評分為89.10分。考慮到實際操作性，設定發酵溫度為15℃、糖度為21°Bx、初始pH值為3.5。對以上最優工藝進行3次平行驗證試驗，感官評分分別為89.76分、89.48分、89.15分，平均值為89.47分，與理論預測值較為接近，故確定瓢兒酒發酵最佳工藝參數：發酵溫度為15℃、糖度為21 °Bx、初始pH值為3.5。

2.3 瓢兒酒品質分析

2.3.1 瓢兒酒感官評價結果

優化后制得的瓢兒酒色澤清亮透明，無明顯的懸浮物，呈現琥珀紅色，有濃郁的果香和酒香味，入口酒體豐滿，甘甜爽口，回味醇香，入喉有余香。

2.3.2 瓢兒酒理化及微生物檢驗結果

瓢兒酒理化指標和微生物指標均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的規定，達到國家標準優級品的要求。

2.4 冷凍過濾澄清瓢兒酒對其色澤和VC含量的影響

2.4.1 過濾溫度對瓢兒酒色澤的影響

表5 不同過濾溫度對瓢兒酒色澤的影響Table 5 Effect of different filtration temperature on the color of pineberry wine

由表5可知，過濾處理瓢兒酒，其亮度值L*值均降低，但當過濾溫度在-5℃以下，瓢兒酒的亮度值L*值與對照品相比無顯著性差異（P＞0.05），色差值ΔE＜2，色澤變化不明顯，說明低溫對其色澤影響較小，可以保持瓢兒酒原有的色澤。當過濾溫度在5～10℃時，其L*值、a*值、b*值均顯著降低，瓢兒酒色差值ΔE＞2，色澤變化顯著。因此，控制過濾溫度保持在-5℃，有利于保持瓢兒酒的色澤。

2.4.2 過濾溫度對瓢兒酒VC保存率的影響

圖5 過濾溫度對瓢兒酒VC保存率的影響Fig.5 Effect of filtration temperature on VC retention rate of pineberry wine

由圖5可知，在過濾的過程中瓢兒酒VC的保存率降低，在-10℃、-5℃條件下過濾時，VC保存率分別為90.03%、88.73%。當溫度升高到10℃時，VC含量顯著降低，VC保存率為75.25%。該現象發生的原因是過濾時瓢兒酒中的VC易與周圍環境中的氧氣發生反應所致，而這一反應與溫度有關，溫度越高，反應活性越強，VC保存率越低。因此，綜合考慮瓢兒酒中營養成分保留及生產成本，試驗選擇過濾溫度-5℃。

3 結論

采用單因素及響應面試驗對瓢兒酒的發酵條件進行優化，建立了瓢兒酒綜合評價的回歸模型，由該模型優化的瓢兒酒發酵條件為：發酵溫度15℃、糖度21°Bx、初始pH值3.5，在此工藝條件下釀得的瓢兒酒綜合評價分數為89分，此時瓢兒酒品質最佳，理化指標和微生物指標均符合檢測標準，達到國家標準優級品的要求。瓢兒酒在過濾時，溫度保持在-5℃，有利于保持瓢兒酒的色澤和VC保存。