銀杏大麥酒的釀造工藝及品質分析

李傲然，胡倬瑜，楊 寧，孫 郡，何靜仁，何 毅*

（武漢輕工大學 食品科學與工程學院 湖北省農產品加工與轉化重點實驗室，大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023）

銀杏（Ginkgo biloba）又名公孫樹。其果實一般為白色，有“白果”之稱，具有長梗，外種皮肉質，味甘略苦。銀杏果實中富含銀杏內酯、黃酮、多酚和銀杏酸等藥用成分。DEKOSKY S T等[1]研究了銀杏在改善記憶和認知方面的相關應用，其還具有益氣溫肺、止喘咳，抗衰老、保護肝臟等功效[2-3]。

大麥營養成分豐富、全面，含有高纖維、高維生素、低脂肪、低糖、多種微量元素以及β-葡聚糖、α-生育三烯醇、黃酮、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、抗性淀粉等多種功能成分[4]。大麥中纖維具有低血糖指數，對糖尿病患者日常生理功能維持有益[5]。AHMEDRM等[6]研究發現，在用雙歧桿菌（Bifidobacterium）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發酵的酸奶中添加大麥β-葡聚糖可以有效降低血漿和肝臟中膽固醇的水平，同時糞便中膽汁酸的排泄增加。IDEHEN E等[7]也研究證明，大麥中富含植物化學物質，具有與癌癥、心血管疾病、糖尿病和肥胖等常見營養相關疾病作斗爭的潛力。

以銀杏果為原料開發的產品眾多，在釀酒方面，由銀杏果發酵而成的純天然有保健功能的銀杏酒也早已進入市場[8]。銀杏果作為優質的釀酒原料，大多都是作為單一的原料用來釀酒。本研究選用銀杏和大麥為原料釀造一種口感良好、營養豐富的銀杏大麥酒，采用響應面法研究其最佳釀造工藝和釀造過程中總酸、總酚、總黃酮含量的變化規律，然后分析銀杏大麥酒的抗氧化活性。為進一步開發兼具銀杏與大麥復合香味、營養豐富、保健功效的銀杏大麥酒提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏果：產自隨州市洛陽鎮；大麥：市售；釀酒高活性干酵母：廣西丹寶利酵母有限公司；安琪高活性酵母：安琪酵母股份有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；蘆丁標準品（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）：碧云天生物技術公司；沒食子酸（標準品）、硫酸亞鐵、水楊酸、酚酞、苯酚等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

STARTER3100 pH計：普蘭德（上海）貿易有限公司；WIATC手持折光儀：上海精密科學儀器有限公司；AL204型電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；SpectraMax M2e酶標儀：美國Molecular Devices公司；Lambda25紫外分光光度計：美國PERKINELMER公司；7890A/5957C氣相色譜質譜聯用儀：美國Aglient公司。

1.3 方法

1.3.2 菌種的活化

稱取適量干酵母，將其投入到10倍35～40℃蒸餾水中，復水15 min，于28℃恒溫培養箱中活化2 h。

1.3.3 酵母菌的篩選

將經處理后（大麥粉碎后與打漿好的銀杏果混合后糊化、糖化）糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調節pH至3.6，然后分別加入0.25%安琪高活性干酵母、廣西丹寶利酵母、混合酵母（安琪高活性酵母和廣西丹寶利酵按1∶1比例混合），在26℃條件下靜置發酵13 d，測定其酒精度和糖度，以確定最佳酵母菌。

1.3.4 銀杏大麥酒發酵條件優化單因素試驗

（1）發酵時間的確定

將經處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調節pH值至3.6，然后添加0.25%高活性干酵母，在26℃發酵15 d，于第1、3、5、7、9、11、13、15天測定酒液中的酒精度和糖度。

（2）初始糖度的確定

將經處理的銀杏大麥汁pH值調至3.6，然后添加0.25%高活性干酵母，調節銀杏大麥汁糖度分別至18°Bx、20°Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx，在26 ℃分別發酵13 d，測定各酒液的酒精度和糖度。

（3）接種量的確定

將經處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調節pH值至3.6，然后分別添加0.10%、0.25%、0.40%、0.55%活性干酵母，在26℃發酵13 d，測定各酒液的酒精度和糖度。

（4）初始pH值的確定

將經處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調節pH值分別至2.4、2.8、3.2、3.6、4.0，然后添加0.25%活性干酵母，在26 ℃分別發酵13 d，測定各酒液的酒精度和糖度。

（5）發酵溫度的確定

將經處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調節pH值至3.6，然后添加0.25%高活性干酵母，分別在18℃、22℃、26℃、30℃、34℃培養箱中發酵13 d，測定各酒液的酒精度和糖度。

1.3.5 銀杏大麥酒發酵條件優化的響應面試驗

在單因素試驗分析結果基礎上，采用Box-Behnken響應面設計方法，選擇初始糖度（A）、接種量（B）、初始pH值（C）和發酵溫度（D）這4個影響較大的因素，設計4因素3水平響應面試驗，以酒精度（Y）為響應值進行優化，因素水平設計見表1。

表1 大麥酒發酵條件優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for ginkgo-barley wine fermentation conditions optimization

1.3.6 理化指標的測定

pH值采用STARTER3100 pH計測定；可溶性固形物（糖度）：采用手持折光儀測定，所得數值均校正為20℃條件下的數值；總酸含量：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中指示劑法測定[9]；酒精度：采用分光光度計法測定[10-11]。

總黃酮含量的測定：吸取質量濃度為0.174 561 mg/mL蘆丁標準液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL的容量瓶中，分別加入5%的NaNO2溶液0.3 mL還原6 min；加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL絡合6 min；加入質量分數為4%（1 mol/L）的NaOH溶液4 mL；最后用體積分數60%乙醇定容，搖勻，顯色20 min。在波長506 nm條件下測定吸光度值，繪制蘆丁標準曲線，得溶液吸光度值A與蘆丁質量濃度C（mg/mL）的回歸方程：A=0.012 7C+0.093 3（R2=0.999 6）。再利用紫外分光光度計測定待測液的吸光度值，然后利用回歸直線方程得出所取樣品液中的總黃酮含量[12]。

總酚含量的測定：采用Folin-Ciocalteu法[13]。精確稱取干燥恒質量的沒食子酸10.0 mg，溶解后加水定容到100 mL，配成0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。準確吸取沒食子酸標準溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，于10 mL刻度試管中，加5.0 mL蒸餾水，再加0.5 mL福林酚試劑，搖勻1 min后再加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，于室溫反應2 h。在波長760 nm處測定標準溶液的吸光度值，得溶液吸光度值A與沒食子酸質量濃度C（mg/mL）的回歸方程：A=9.916C+0.003（R2=0.9997）。

準確量取樣品0.1 mL于10 mL刻度試管中，按標準曲線制備操作步驟于760 nm波長處進行吸光度值的測定（樣液如有沉淀，應過濾后測定）。根據標準曲線的線性方程計算總酚含量。

1.3.7 抗氧化能力測定

（1）羥基自由基清除能力的測定

參照文獻[14]采用水楊酸法，于波長510 nm處測定吸光度值。羥基自由基清除率按下式計算：

式中：A0為空白對照的吸光度值；A1為無水楊酸時樣品的吸光度值；A2為加入樣品后的吸光度值。

（2）DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻[15-16]采用DPPH·法測定清除DPPH·能力。在波長517 nm下測定吸光度值。DPPH·清除率按下式計算：

式中：A0為DPPH·與無水乙醇混合液的吸光度值；A1為無水乙醇調零，加入樣品溶液后的吸光度；A2為樣品溶液與無水乙醇混合液的吸光度值。

（3）ABTS法測定總抗氧化能力

采用ABTS法測定總抗氧化能力。在波長735 nm下測定各種濃度的Trolox標準溶液吸光度值。得到并根據標準曲線（A=-0.778 9C+1.224 5（R2=0.999 3））計算出樣品的總抗氧化能力[17]。

1.3.8 數據處理

采用SPSS19.0軟件，對試驗結果進行統計分析，統計方法采用方差分析進行各試驗組間的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種的確定

表2 不同酵母對酒精發酵的影響Table 2 Effect of different yeasts on alcoholic fermentation

不同菌種對酒精發酵的影響見表2。在廣西丹寶利酵母發酵時，發酵液中酒精度最高，由此可知，廣西丹寶利酵母的發酵能力和速率優于安琪高活性酵母和混合酵母。此外，在使用廣西丹寶利酵母發酵時，消耗了相對較少的糖分卻產生較高的酒精度，綜合考慮選擇廣西丹寶利酵母作為銀杏大麥酒的發酵用酵母。

2.2 銀杏大麥酒發酵條件優化單因素試驗

2.2.1 發酵時間對銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

發酵時間對酒精發酵影響的結果見圖1。發酵初期的1～7 d，發酵液中的糖含量急劇降低，同時發酵液的酒精度上升至10%vol左右，發酵至13 d時酒精度達到最大值（11.3%vol）。后續發酵銀杏大麥酒的酒精度不變，發酵時間過長，對果酒的品質風味會有所影響，綜合考慮，發酵時間定為13 d。

圖1 發酵時間對酒精發酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on alcoholic fermentation

2.2.2 初始糖度對銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

初始糖度對酒精發酵影響的結果見圖2。由圖2可知，經同時段發酵，發酵液中酒精度隨著初始糖度的增加呈先增后減的趨勢。因為糖既是酵母菌的生長繁殖的“必需品”，也是其代謝合成酒精等物質的原料。因此，隨著發酵液中初始糖度的增加，酵母菌的生長和代謝速率都加快，酒精產生量增加，但糖度過高則會抑制酵母菌生長繁殖和代謝。綜合考慮，確定22°Bx為銀杏大麥酒發酵的最佳初始糖度。

圖2 初始糖度對酒精發酵的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on alcoholic fermentation

2.2.3 酵母菌接種量對銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

接種量對酒精發酵影響的結果見圖3。由圖3可知，隨著接種量的增加，發酵液中糖度持續降低，酒精度呈先增后減趨勢。結果表明在一定范圍內，釀酒酵母接種量適當增加有利于發酵過程的快速啟動和代謝產物生成，有利于酒精的生成，減少污染雜菌的機會[18]。綜合考慮，確定0.25%為銀杏大麥酒發酵的最佳酵母菌接種量。

圖3 接種量對酒精發酵的影響Fig.3 Effect of inoculum on alcoholic fermentation

2.2.4 初始pH值對銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

由圖4可知，從pH值2.4開始，隨著發酵液初始pH值逐漸增大，銀杏大麥酒的酒精度呈先增后減趨勢，當發酵液初始pH值為3.6時，酒體中酒精度達到最高。出現變化主要原因是酵母有適合其生長、繁殖和代謝的pH范圍。當pH過低或過高時，酵母的生長和繁殖受到抑制，代謝活性降低，產生的酒精量減少。因此，確定pH值3.6為銀杏大麥酒釀造的最佳初始pH值。

圖5 發酵溫度對酒精發酵的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on alcoholic fermentation

2.3 銀杏大麥酒發酵條件優化響應面試驗

2.3.1 響應面設計及結果

將初始糖度、接種量、初始pH值和發酵溫度作為評價因素，以銀杏大麥酒的酒精度（Y）為響應值，共設29個試驗點，銀杏大麥酒的響應曲面試驗設計方案與試驗結果如表3所示。利用Design-Expert軟件對表3中試驗數據進行多元回歸擬合，得到酒精度（Y）對自變量A（初始糖度）、B（接種量）、C（初始pH值）、D（發酵溫度）的回歸方程[18]：

圖4 初始pH值對酒精發酵的影響Fig.4 Effect of initial p H value on alcoholic fermentation

2.2.5 發酵溫度對銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

由圖5可知，發酵溫度從18℃升高到34℃時，發酵液中酒精度含量呈先增后減趨勢。26℃時發酵液中酒精度最高、糖度最低。主要原因是溫度影響酵母菌的生長，隨著溫度升高，酵母對糖的消耗以及代謝產生酒精的速率加快。當溫度過高時，酵母老化加快，導致產生的酒精量減少，容易造成雜菌污染，嚴重影響銀杏大麥酒的風味和口感。因此，選擇26℃作為銀杏大麥酒的最佳發酵溫度。

表3 大麥酒發酵條件優化Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for ginkgo-barley wine fermentation conditions optimization

續表

2.3.3 響應面交互作用分析

銀杏大麥酒酒精度對初始糖度、接種量、初始pH值和發酵溫度4因素回歸模型的響應曲面和等高線如圖6所示。在交互作用對銀杏大麥酒的酒精度影響中，初始糖度與初始pH值的交互作用最顯著（P＜0.01），其次是接種量與初始pH值的交互作用顯著（P＜0.05），而初始糖度與接種量、初始糖度與發酵溫度、接種量與發酵溫度和初始pH值與發酵溫度的交互作用不顯著（P＞0.05），這與方差分析結果一致。

2.3.2 回歸模型的方差分析

對銀杏大麥酒發酵條件的數學模型進行方差分析，以檢驗方程的有效性和各因子的偏回歸系數，回歸模型的方差分析如表4所示。由表4可知，該試驗選用的模型極顯著（P＜0.01），方差的失擬項不顯著（P=0.074 0＞0.05），即模型選擇合適；同時，所選模型的校正決定系數R2=0.941 7，表明此模型能解釋94.17%的結果值變化，僅有總變異5.83%不能用該模型解釋，基本可用于銀杏大麥酒發酵條件的分析和預測。在此試驗設計的作用因素中，一次項A（初始糖度）、C（初始pH值）、D（發酵溫度）、二次項A2、B2、C2、D2及交互項AC對銀杏大麥酒酒精度的影響極顯著（P＜0.01），交互項BC對銀杏大麥酒酒精度的影響顯著（P＜0.05），B（接種量）及交互項AB、AD、BD、CD對銀杏大麥酒酒精度的影響均不顯著（P＞0.05）。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

圖6 初始p H值、初始糖度以及接種量的交互作用對銀杏大麥酒酒精度影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour line of effects of interaction between initial pH value,sugar content and inoculum on the alcohol content of ginkgo-barley wine

2.3.4 最佳發酵條件的確定

根據Box-Behnken Design試驗分析的結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.0.6.1軟件，可獲得銀杏大麥酒的最佳發酵條件，即初始糖度22.80°Bx、接種量0.24%、初始pH值3.70、發酵溫度27.0℃。在此最優條件下，銀杏大麥酒的酒精度最高，為11.51%vol。為驗證此模型的可靠性，在最優條件下進行3次平行試驗，結果表明，所得銀杏大麥酒的平均酒精度為11.46%vol；與理論預測值相比，其相對誤差約為0.43%，說明模型可以較好地反映出銀杏大麥酒的發酵條件，也再次證明了通過響應曲面法對銀杏大麥酒的發酵條件進行優化是可行的。

2.4 發酵過程中總酸含量的變化

發酵過程中總酸含量的變化如圖7所示，銀杏大麥酒的總酸含量在發酵過程中呈現先顯著上升后緩慢下降的趨勢，在發酵第3天時達到最高，為121 mg/100 mL。原因是酵母菌在發酵前3 d的發酵過程中也會形成少量的有機酸，如乙酸、月桂酸、檸檬酸和酒石酸等[20]，使酒液的總酸呈顯著上升趨勢。在發酵后期，總酸含量在保持穩定的基礎上略有下降，保持在80～100 mg/100 mL，是因為二氧化碳緩慢溢出，同時部分酸性物質轉化成了酯、醛、酮等其他物質，使總酸含量緩慢下降。

圖7 發酵過程中總酸含量的變化Fig.7 Changes of total acid content during the fermentation

2.5 發酵過程中總酚含量的變化

發酵過程中總酚含量的變化如圖8所示，銀杏大麥酒中的總酚含量呈現先上升后下降，最后小幅升降的趨勢。發酵前期由于出汁量較多或者產生的乙醇有利于酚類物質的溶出，使過久的總酚含量增加，并在發酵第2天時達到最高，為0.34 mg/mL。隨著氧化時間延長，隨著酵母菌和銀杏果和大麥原始菌群的生長繁殖，微生物在代謝過程中產生的酶會使多酚類物質發生降解，使得總酚含量呈下降趨勢。7～13 d，總酚含量呈小幅升降的趨勢，這可能是由于之前未溶出的酚類物質隨著發酵時間的推移慢慢溶出及后續慢慢被氧化造成的[21-22]。

圖8 發酵過程中總酚含量的變化Fig.8 Changes of total phenols content during the fermentation

2.6 發酵過程中總黃酮含量的變化

發酵過程中總黃酮含量的變化如圖9所示，在銀杏大麥酒的前酵階段，發酵時間不超過2 d時，黃酮含量下降速度較快，而在銀杏大麥酒的后酵階段，發酵7 d后，銀杏大麥酒中黃酮含量下降較緩慢，并趨于平穩。總黃酮的含量呈下降趨勢，是由于黃酮難溶于水而較易溶于乙醇溶液，隨著發酵過程的進行將有越來越多的黃酮遷移至酒體中。從而銀杏大麥酒和大麥銀杏酒中的黃酮的含量明顯下降。

圖9 發酵過程中總黃酮含量的變化Fig.9 Changes of total flavonoids content during the fermentation

2.7 抗氧化性的變化

2.7.1 羥基自由基清除能力的測定

由圖10所示，羥基自由基的清除率緩慢上升，最終數值穩定在98%左右。是由于銀杏大麥酒中功能性成分如總酚、多糖等含量較高，這些功能性成分對·OH具有較好的清除能力。

圖10 不同發酵時間大麥酒的羥基自由基清除率Fig.10 Hydroxyl radical scavenging rate of ginkgo-barley wine with different fermentation time

2.7.2 DPPH自由基清除能力的測定

如圖11所示，銀杏大麥酒對DPPH自由基清除率呈先升后降，之后趨于穩定的趨勢，最后測量值穩定在37%左右。發酵前期與總酚的變化基本一致，在發酵前期抗氧化能力提高是由于酚類化合物含量增加引起的，之后的下降是由于酚類物質被氧化或被酶解造成的，也可能因為黃酮的不穩定性及發酵過程中產生的酶分解了酚類等大分子物質，導致抗氧化性降低。

圖11 不同發酵時間大麥酒的DPPH自由基清除率Fig.11 DPPH radical scavenging rate of ginkgo-barley wine with different fermentation time

2.7.3 總抗氧化能力測定

如圖12所示，總抗氧化性能力總體呈先升后降，之后趨于平穩的趨勢，總抗氧化能力的變化可能與發酵過程中酚類物質解離和聚合等復雜反應以及銀杏果實中游離酚和結合酚的含量有關[23]。由圖8和圖12可知，銀杏大麥酒中總酚含量與總抗氧化能力的變化基本一致。

圖12 不同發酵時間大麥酒的總抗氧化能力變化Fig.12 Total antioxidant capacity changes of ginkgo-barley wine with different fermentation time

3 結論

以銀杏果和大麥為原料，采用單因素試驗和Box-Behnken試驗設計對銀杏大麥酒的釀造工藝進行優化，得到最佳工藝條件：初始糖度22.80°Bx、接種量0.24%、初始pH值3.70、發酵溫度27.0℃。在該工藝下釀造的銀杏大麥酒的酒精含量在11.4%vol左右，屬于低酒精度飲料酒。銀杏大麥酒經發酵后總酸含量維持在80～100 mg/100 mL，總酚含量保持在0.3 mg/mL左右，其羥基自由基清除率穩定在98%左右，DPPH自由基清除率穩定在37%左右，總抗氧化性能力指標保持在較高的水平。但釀造過程中酒體中黃酮類物質會有一定程度的損失，因此還需要對釀造工藝進行改進，以最大程度的保留黃酮類物質，以進一步增強其保健功能。