生物技術藥物脫酰胺化檢測方法概述*

李恒，何雁南，馬吉勝，劉姍姍，周朝暉

(1.武漢藥品醫療器械檢驗所，武漢 430075；2.溫州醫科大學藥學院，溫州 325035；3.東北大學化學與生物化學系，巴奈特化學與生物分析研究所，美國波士頓 02115)

近年來，我國生物醫藥行業迅速蓬勃發展。據艾美仕(Intercontinental Marketing Services，IMS)預測，到2020年，我國生物醫藥市場將成為僅次于美國的全球第二大生物醫藥市場，其中抗體藥物和蛋白藥物等生物技術藥物未來可產生3000億～5000億元市場。據2016年不完全統計，我國已批準上市的生物技術藥有44種[1]，并且獲批品種數量還在逐年增加。隨著《中華人民共和國藥典》2015年版的實施，生物技術藥物的質量控制將會大幅提高，質量標準逐步與國際接軌，藥品質量將達到國際水平。

生物技術藥物不同于傳統的小分子藥物，生產、儲存及運輸條件等因素的改變都會引起其蛋白的異構、變性，從而引起難以預測的臨床藥物不良反應。脫酰胺化(deamidation)是常見的蛋白翻譯后修飾形式，普遍存在蛋白、多肽類藥物中。異天冬氨酸(isoaspartic acid，isoAsp)是脫酰胺化的特異性降解產物，其存在量能反映藥物脫酰胺化的程度。因此，國外生物藥品生產企業在向美國食品藥品管理局(FDA)、歐盟藥品管理局(EMA)申報藥品資料時都會提供該申報藥品脫酰胺化的相關檢測數據。饒春明等[2]對2015年版《中華人民共和國藥典》生物技術藥質量控制相關內容進行切實詳盡的闡述，并以人用重組 DNA 蛋白制品為例，其中指出氨基酸序列測定時應考慮各種可能的翻譯后修飾(如脫酰胺化、氧化、異構化等)[3]。韋薇等[4]將脫酰胺化列入重組單克隆抗體產品相關物質或雜質研究范圍。這些生物技術藥物發生脫酰胺化的可能性非常高，其結果有待研究與分析。

隨著生物技術藥物的發展，脫酰胺化研究報道也越來越多[5-6]。目前為止《中華人民共和國藥典》及法規都尚未對生物技術藥物中脫酰胺化作出指導方法或建立明確的標準，也沒有對其產生的isoAsp進行必要的定性定量檢測。因此筆者對脫酰胺化的檢測方法在國內外研究的進展綜述如下。

1 脫酰胺化及其對生物技術藥物的影響

1.1脫酰胺化定義 脫酰胺化是指多肽或蛋白中天冬酰胺(asparagine，Asn)殘基自發的非酶催化的脫酰胺反應。Asn脫去其側鏈上的氨基，形成五元環的琥珀酰亞胺中間體，進而水解形成天冬氨酸(aspartic acid，Asp)和isoAsp。谷氨酰胺(glutamine，Gln)殘基也能發生脫酰胺化，但發生較少且轉化速率較Asn慢得多，產生量也很低[7-9]，這里主要討論Asn脫酰胺化。

1.2影響脫酰胺化因素 脫酰胺化反應的發生是個極其復雜的過程，isoAsp的產生速度取決于多種因素，包括蛋白質多肽的原始序列、構象、pH值和溫度等。在沒有固定空間結構的肽中，位于Asn或Asp的C端殘基起主要作用；作為最靈活和酸性(主鏈酰胺)的Asn-甘氨酸(glycine，Gly)(NG)在生理條件下表現出最高的脫酰胺速率(半衰期約1 d)； Asn-絲氨酸(serine，Ser)(NS)和Asn-組氨酸(histidine，His)(NH)，在酸催化條件下，除NG外脫酰胺速率比大多數其他序列要快得多；由于脯氨酸(proline，Pro)中含有仲胺，因此Asn-Pro(NP)并沒有觀察到脫酰胺反應。總而言之，蛋白質多肽中含NG結構很可能發生，含NS結構可能發生，而含NP大多不發生脫酰胺化。在生理條件下，Asp異構化速率約為Asn的1/40[10]。而琥珀酰亞胺中間體通常以3：1的比例水解成isoAsp和Asp[11-12]。生物信息學分析和實驗研究均表明，蛋白質中Asn(～4%)和Asp(～5%)生成isoAsp概率均較高，而isoAsp是普遍存在且發揮著不同作用。

1.3脫酰胺化對生物技術藥物的影響 isoAsp是普遍存在的，它會改變蛋白質的結構和功能[13-14]。許多生物技術藥物在生產、儲存等過程中都有可能發生非酶催化的脫酰胺化反應，這將對其結構與穩定性產生影響[15]，從而造成藥物本身活性的降低甚至完全喪失，如重組人干細胞因子[16]、重組人免疫球蛋白抗體E[17]、重組人生長激素[18]等。不僅如此，科學家們在多個領域的研究中發現脫酰胺化及可能的重要影響，包括對神經生物學，細胞粘附，癌癥和免疫原性的影響[19-20]。

1.4脫酰胺化研究的難點 isoAsp的形成可以說是最常見的蛋白質翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)之一，并且它是最小的PTM。首先，鑒定含有isoAsp的蛋白質已經非常困難，而且還需在蛋白質中將其精確定位；其次，isoAsp和Asp是相同質量的異構體，并不能通過質譜法直接將二者進行區分；最后，isoAsp的產生是個動態變化的過程，建立準確定量的檢測方法十分困難。因此尋找準確合適的方法將其區分并測定，是許多實驗研究人員努力的方向。

2 脫酰胺化的檢測方法

2.1處理方法 少量多肽藥物不需酶切，如重組人胰島素、重組人生長激素等，加入適當濃度的鹽酸或緩沖液，在室溫放置24 h，采用高效液相色譜(HPLC)法可以直接有效地分離脫胺組分或產物。《中華人民共和國藥典》2015年版已收入上述兩個品種，并對其對應的脫胺組分有相應的檢查要求[21]。徐軍等[5]對《中華人民共和國藥典》重組人胰島素注射液中有關物質檢查方法進行優化，并用質譜(mass spectrometry，MS)鑒定B3和B3iso脫氨人胰島素。

生物技術藥物相對分子質量大，通常需使用胰蛋白酶等內切蛋白酶進行消化水解成多肽片段(必要時進行富集)，然后在一定的溫度下，將肽段在醋酸銨或碳酸氫銨緩沖液中進行孵化，最后利用酶法[異天冬氨酸甲基轉移酶(proteinL-isoaspartyl methyltrans-ferase，PIMT)、天冬氨酸肽鏈內切酶Asp-N(endoprotease Asp-N)]、同位素標記(18O)法等進行進一步處理，進而采用不同分析儀器對isoAsp進行鑒定或含量測定。

①PIMT。該方法是最常見最有效的用于蛋白藥物中isoAsp定性定量檢測手段之一[15，22]，通常采用ISOQUANT?Isoaspartate Kit試劑盒進行測定。其原理是利用PIMT特異性，通過催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，AdoMet，SAM)上甲基轉移到isoAsp的α-羧基位置上，生成琥珀酰亞胺中間體，隨后在甲基化過程中自發分解并釋放甲醇；而SAM失去-CH3生成S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)。采用HPLC測定生成的SAH含量，從而間接對isoAsp定量。該方法以isoAsp-DSIP作為對照品，isoAsp在5～250 pmol·L-1濃度的范圍內，其含量與SAH峰面積之間有良好的重復性和線性關系；蛋白或多肽濃度范圍應控制在7.5～37.5 pmol·L-1。畢華等[6]利用該方法對重組人血管內皮生長抑制劑中isoAsp的含量進行測定，表明生物技術藥物的質量越來越受到我國監管部門的重視，脫酰胺化的檢測將會在未來幾年內逐步開展。該方法不足在于：它只能全面定量Asn和Asp所有位點上的isoAsp殘基，而不能確證每個單獨位點的信息；不能用于檢測Gln的脫酰胺化；也不能檢測位于肽N-末端isoAsp殘基。

ALFARO等[23]應用PIMT選擇性地將isoAsp生成其甲酯，再將不穩定甲酯在水溶液中加入強親核試劑，如肼(hydrazine)形成酰肼(hydrazide)，采用基質輔助激光解吸電離質譜(matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS)可以檢測出比原物質相對分子質量大14的酰肼產物，從而有效地確定脫酰胺化位點。此外，穩定的酰肼產物還可以用醛樹脂進行富集或者加入具有熒光基團的丹磺酰氯進行選擇性修飾生成含磺酰基團的產物(sulfonyl hydrazide)，再通過含紫外(ultraviolet，UV)檢測器(檢測波長為280 nm)或熒光檢測器的HPLC進行定量分析。肽酰肼類物質具有很高選擇性和顯著親和力，富集效果好，此方法的出現使檢測復雜的系統isoAsp成為可能，實現了對isoAsp的有效定位與定量檢測。

②Asp-N可以選擇性水解Asp而不影響isoAsp。NI等[24]利用Asp-N這一特性，提高isoAsp的檢測峰度，通過電子捕獲/轉移質譜法(electron capture dissociation/electron transfer dissociation-MS，ECD/ ETD-MS)對isoAsp進行精確的檢測和定性定量分析。該方法的缺點是：在樣品前處理過程中，此酶Asp-N活性條件下的pH容易引起樣品的脫酰胺化的發生，從而造成一定假陽性的結果。

③蛋白內切酶(endoprotease Glu-C)。在蛋白質脫酰胺化的分析中，常用pH值 8.0 的酶解反應條件，而在此條件下樣品容易發生新的脫酰胺化，所測得的脫酰胺水平遠高于樣品中的實際值[25]。為了避免和減少樣品前處理過程中發生的這些假陽性現象，LIU等[26]發現，在pH 值4.5條件下，Glu-C同樣可以有效酶解樣品，且樣品在酶解過程中幾乎不發生新的脫酰胺化，從而使測得的脫酰胺水平更接近樣品中的真實值。這一發現降低檢測大分子蛋白藥物中isoAsp假陽性現象，能夠真實有效地分析樣品中isoAsp的情況，進一步完善了脫酰胺化的檢測方法。

2.2儀器方法

2.2.1HPLC法 HPLC法是蛋白質分離最常用最有效的分析方法，在脫酰胺化中主要用于相應脫氨組分、isoAsp的定量測定等。

2.2.2電泳法 蛋白質脫酰胺后會引入負電荷，使其保留時間增加，因此電泳法也被用作脫酰胺化的檢測[30]。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)是早期采用的檢測方法之一[31]。隨著電泳技術的發展，新的電泳技術也在逐步應用。等電焦集電泳(isoelectric focusing electro-phoresis，IEF)是依據蛋白質分子等電點(isoelectric point，IP) 的不同來作分離，其解析度非常好，因此在蛋白質脫酰胺化中也有應用[32-33]。上述兩種電泳法得到的電泳圖可以較直觀地反映脫酰胺組分。毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)或高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是凝膠電泳技術的發展，HPLC分析的補充。與普通SDS-PAGE比較，CE具有分辨率高、分離效率快等優點；與HPLC比較，CE分離機制不同，可應用于HPLC不易分離的樣品。但在某些程度上，其方法復雜，結果重復性差。結合了質譜的CE可以對樣品進行更全面的分析，可對蛋白質復合物及翻譯后修飾產物進行分析。

《中華人民共和國藥典》2015年版三部收錄電泳法(通則0541)，其主要用于蛋白質鑒別、相對分子質量及IP檢測。張瑩[31]對重組人胰島素中脫胺胰島素檢測方法(PAGE、HPLC、CE)進行介紹。LEWIS等[34]和SKOTTNE等[35]分別采用SDS-PAGE對重組人生長激素不同的脫酰胺產物進行分離。NIELSEN等[36]采用CE對生物合成人胰島素和人生長激素不同脫酰胺產物進行分離，并定量測定。

2.2.3離子交換色譜法(ion exchange chromatography，IEC) 20世紀90年代初期，IEC被用于蛋白質脫酰胺的分析[37]，但Asp與isoAsp兩者不易分離使其在脫酰胺研究上存在局限性，隨著IEC與HPLC的結合，有了進一步的發展。ZHANG等[33]將單克隆抗體中的多肽片段與PIMT進行酶促反應，通過強陽離子交換(strong cation exchange，SCX)-HPLC分離各型脫酰胺產物，用HPLC-UV測定其isoAsp總量。VLASAK等[38]通過離子交換(cation exchange，CEX)-HPLC分離、結合質譜，鑒定重組人源化單克隆IgG1抗體(humanized IgG1 monoclonalantibody，MAb)的輕鏈互補決定區1(complementarity determining region 1，CDR1)中Asn33脫酰胺化，用ISOQUANT Kit檢測其含量。

2.2.5聯合應用 由于isoAsp檢測的復雜性，為了更好地確認發生脫酰胺化的位點，并且能有效地將Asp與isoAsp分離，多種檢測技術聯合應用被人們廣泛采用。ZHANG等[42]在對重組人白細胞介素11進行脫酰胺化研究時，采用SDS-PAGE、HPLC結合胰蛋白酶肽圖、CE結合Asp-N肽圖以及LC/MS四種儀器方法進行分析，對發生脫酰胺化的位點進行準確定位，最后利用PIMT采用SCX-HPLC檢測方法對isoAsp的總量進行定量測定。

綜上所述，在生物技術藥物脫酰胺化檢測中，每種方法都有其特點(表1)，因此通常采用幾種方法聯合應用以達到對isoAsp精確定位，準確定量的目的。

表1 不同方法在脫酰胺化檢測中的特點

續表1 不同方法在脫酰胺化檢測中的特點

3 前景與展望

目前，我國生物技術藥品中涉及脫酰胺產物的檢測項目較少，且未對生物技術藥品中的isoAsp含量進行檢測作任何要求，相關定性定量檢測方法幾乎處于空白。開展建立高效、準確測定生物技術藥物中脫酰胺產物，特別是isoAsp的含量方法，使生物技術藥物質量標準與國際接軌，可以對生產及市場流通的生物技術藥物的質量起到監管的作用，從而更好地保障廣大人民的生命健康和用藥安全。脫酰胺化檢測技術不斷發展，如何將這些檢測方法更加合理地應用到生物技術藥物的實際檢測中去，建立高效、準確的質量標準是值得我們思考的課題。