異葉青蘭總黃酮對去甲腎上腺素誘導大鼠心肌細胞肥大的抑制作用*

蔣紅，何雯，2，張晨

(1.新疆醫科大學護理學院，烏魯木齊 830011，2.長沙市第一醫院藥學部，長沙 410005)

心肌肥大(cardiac hypertrophy)是心臟應對長期壓力超負荷緩慢產生的一種代償機制，常伴隨蛋白質合成增加、心臟結構重構和細胞器的功能障礙，主要表現為心肌細胞體積增大、膠原纖維形成的肌節增加及胚胎基因的再表達，是先天性心臟病、高血壓、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病共有的病理過程[1]。導致心肌肥厚的因素除機械因素(各種原因導致的壓力或容量超負荷)外，神經體液性因素，如去甲腎上腺素(noradrenaline，NE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、甲狀腺素、加壓素、內皮素以及多種生長因子等，也在心肌肥厚的進展中起著重要作用[2]。其中，NE是體內主要的交感神經遞質和內分泌激素，在病理情況下，可誘發心肌細胞肥大、凋亡以及心肌細胞壞死等心肌重塑，是公認的心肌肥厚因子[3]。研究表明，NE主要通過腎上腺素能α1和β受體誘導心肌肥厚。α1受體與Gq蛋白耦聯，β腎上腺素能受體與Gs蛋白耦聯。α1受體激活后可激活細胞內磷酸酯酶 C(phosphatase C，PLC)，水解4，5-磷酸肌醇二磷酸(4，5-inositol phosphate diphosphate，PIP2)，升高三磷酸酯(triguaiacyl phosphate，IP3)和甘油二酯(diglyceride，DAG)，DAG的升高可激活蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)。β腎上腺素能受體激活后可活化腺苷酸環化酶(adenyl cyclase，AC)，使三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)轉變成環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，細胞內cAMP蓄積，cAMP的增多可激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)。PKC和PKA的激活是導致心肌肥厚的關鍵步驟，二者都可激活MAPK信號轉導通路，引起心肌肥厚[4]。異葉青蘭是維吾爾族及藏族民間傳統用藥，有研究表明，其具有治療高血壓、肺熱咳嗽、支氣管炎等功效，具有良好的抗氧化活性，且本課題前期研究發現，異葉青蘭總黃酮(DracocephalumHeterophyllumBenth flavonoid，DHBF)可降低腎血管性高血壓大鼠血壓，可改善左室收縮舒張功能和心肌收縮力，其作用機制尚不明確[5]。因此，筆者在本研究擬進一步觀察DHBF對NE誘導的大鼠心肌細胞肥大的影響，體外實驗探討DHBF對心肌細胞肥厚的抑制作用，為進一步探討其作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD新生乳鼠，出生3 d內，由新疆醫科大學第一附屬醫院實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK(新)2003-0001。飼養于新疆醫科大學一附院科技樓SPF環境，許可證號：SYXK(新)2010-0003。動物合格號：No.65000700000650。

1.2藥品、試劑與主要設備 DEBF：異葉青蘭于2016年7—8月在新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州阿克陶縣奧依塔克鎮奧依塔克村收集，經中國科學院新疆生態與地理研究所植物分類研究室沈觀冕研究員鑒定為青蘭屬植物異葉青蘭全草。其后由新疆理化技術研究所進行晾干、粉碎，浸泡于50倍體積70%乙醇，回流提取3次，合并提取液，然后用AB-8大孔吸附樹脂純化制備，提取液趁熱濾過去除不溶性沉淀，加分離劑冷卻析出棕色結晶，離心，沉淀物經70 ℃烤干即為DEBF，經鑒定總黃酮含量為560 g·kg-1；去甲腎上腺素(美國Sigma公司，批號：SLBC0359V)；哌唑嗪(上海信裕生物科技有限公司，批號：100164-201602)；胎牛血清(FBS，上海橋星貿易有限公司，批號：1616756)；雙抗(青霉素鏈霉素溶液，美國Hy Clone公司，批號：J170006)；D-Hanks溶液(石家莊博士德軟件科技開發有限公司，批號：09I22C75)；胰蛋白酶(美國Sigma公司，批號：J170007)；Ⅱ型膠原酶(美國Worthington公司，批號：46D16553)；谷氨酰胺(美國Sigma公司，批號：RNBF4742)；CCK-8細胞試劑盒(石家莊博士德軟件科技開發有限公司，批號：NO60410)；定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(德國Thermo有限公司，批號：AK9403)；逆轉錄酶試劑盒(德國Thermo有限公司，批號：152104)；抗鈣調素蛋白酶(calcineurin，CaN)抗體(英國Abeam公司，批號：ab32117)；抗T 細胞核活化因子-3( T nuclear activator factor -3，NFAT-3)抗體(英國Abeam公司，批號：ab23E6)；羊抗兔 IGg 二抗(英國Abeam公司，批號：ab205718)；抗心肌肌鈣蛋白T抗體(英國Abeam公司，批號：GR274050)；Dy Light594標記驢抗鼠Ig G二抗(英國Abeam公司，批號：GR287651)；Triton-100(美國 Sigma公司，批號：201601)；DAPI(霍夫曼·羅氏公司，批號：11L19B76)；封閉液驢血清(北京索萊寶科技有限公司，批號：201607)；LSM 710共聚焦顯微鏡((LEICA公司，德國)；逆轉錄儀(Bio-RAD)；定量PCR儀(ABI 7500)。

1.3方法

1.3.1心肌細胞培養 參照文獻[6]的方法。 乳鼠無菌開胸，迅速取出心臟，置于盛有4 ℃ 的D-hanks 溶液培養皿中，清除殘留血液，減去心臟的1/3～1/2，留心尖部心室組織后，分別沿橫、縱兩個方向剪開，使心尖部相連，呈花瓣狀。加入 0.1%胰蛋白酶溶液，置于搖床上，4 ℃震蕩過夜。第2天加入與胰蛋白酶等量的培養液，置37 ℃水浴箱震蕩10 min后終止消化。加入0.08 %Ⅱ型膠原酶置37 ℃水浴箱震蕩消化4或5次，每次10 min。消化完畢后，細胞用孔徑0.075 mm(200目)的尼龍篩網除去殘留的組織塊，用達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)制成單細胞懸液，吹打均勻，接種于100 mm培養皿中，置于 5%二氧化碳(CO2)，37 ℃ 培養箱中靜置90 min 差數貼壁后，取上清液，并加入 0.1 mmol·L-1Brdu抑制非心肌細胞增殖，細胞分別以1.5×106·L-1接種于60 mm培養皿、3×105·L-1接種于96孔板和1×106·L-1接種于6孔板中，用含10 %小牛血清的 DMEM 培養液培養 48 h后，換無血清培養液。顯微鏡下可見細胞單層同步搏動，頻率70～90 次·min-1，此心肌細胞用于以下實驗。

1.3.2實驗分組 ① 正常對照組；②模型對照組(給予NE造模)；③哌唑嗪組(NE造模后給予哌唑嗪50 μmol·L-1) ；④DHBF低濃度組 (NE造模后給予DHBF 10 μmol·L-1) ；⑤DHBF中濃度組 (NE造模后給予DHBF 25 μmol·L-1)；⑥DHBF高濃度組 (NE造模后給予DHBF 50 μmol·L-1)。

1.3.3細胞肥大模型的建立及給藥 將“1.3.1”項心肌細胞用NE(2 μmol·L-1)作用 48 h，即可誘導心肌細胞肥大[7]。用不同濃度DEBF(10，25，50 μmol·L-1)和哌唑嗪(50 μmol·L-1)作用細胞30 min后，加入NE(2 μmol·L-1)，作用 48 h 后進行各項指標的測定。將未給予任何處理的細胞作為正常對照組。

1.3.4細胞生存率檢測 細胞生存率用 CCK-8 法進行測定。將接種在96 孔板的各組原代心肌細胞進行處理，對照組加入0.5% DMSO作為溶媒對照，其他各組用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入CCK-8檢測液10 μL孵育 2 h，于波長430 nm處檢測吸光度值(A值)。檢測過程中設立不加細胞的調零孔。實驗每組設復孔5個，重復3次，取平均值。細胞存活率(%)=(待測組A430 nm值-調零組A430 nm值)/(細胞對照組A430 nm值-調零組A430 nm值)×100%。

1.3.5RT-PCR法檢測心肌細胞中c-jun和BNP的mRNA表達水平 將接種在60 mm培養皿中的各組原代心肌細胞中加入 TRIzol試劑1 mL裂解細胞，收集細胞裂解液，三氯甲烷抽提，異丙醇沉淀，用 DEPC處理水回收總RNA，紫外分光光度計A260/A280鑒定其濃度及純度，并反轉錄成cDNA。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 20 s，40 個循環。取cDNA 1 μg進行 RT-PCR 檢測c-jun原癌基因和腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)的表達，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參因子，以2-ΔΔct法計算目標基因的相對表達水平。 PCR 引物由上海生工有限責任公司提供，序列見表 1。

表1 PCR引物序列

1.3.6Western blotting蛋白檢測心肌細胞Ca N、NFAT蛋白表達水平 蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白并定量，凝膠電泳后電轉移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗CaN、NFAT-3，GAPDH(內參)，抗體稀釋均為1：1000，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(HRP 羊抗兔IgG 1：2000)，搖床室溫孵育1 h，洗膜后用電化學發光(electrochemiluminescence，ECL) 液進行曝光顯影，Bio-Rad成像分析系統進行圖像采集及分析，以目的蛋白與內參蛋白GAPDH灰度值的比值代表目的蛋白相對表達水平。

1.3.7激光共聚焦進行心肌細胞的鑒定及心肌細胞表面積的檢測 取出接種在6孔板用藥處理過各組心肌細胞，棄培養基，用 PBS 清洗細胞3 次，用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.25%Triton X-100透化10 min，驢血清室溫封閉30 min，加入抗心肌肌鈣蛋白T抗體室溫孵育1 h。加入熒光二抗，避光室溫孵育1 h。避光加入1 g·mL-1的DAPI 3 min。心肌細胞圖像通過 LSM 710 的激光共聚焦儀獲取。每次獨立實驗中，每組各取 3 孔細胞進行處理，重復實驗3 次。每孔細胞樣品隨機獲取 5 個不同視野的圖片，每個圖片取10個細胞，并通過 Image-Pro Plus 6.0 軟件測量 3 次實驗的細胞表面積，以細胞對照組均值為標準，其余組表面積與細胞對照組相除，得出心肌細胞相對平均表面積。

2 結果

2.1DHBF對細胞生存率的影響 CCK-8檢測各組細胞生存率見表2。與正常對照組比較，模型對照組細胞生存率明顯下降(P<0.05)；與模型對照組比較，使用 DHBF 處理的細胞生存率明顯升高，其中DHBF中、高濃度組細胞活性最為顯著(P<0.05)。結果表明DHBF可使 NE 誘導的心肌細胞的生存率提高。

表2 6組肥大心肌細胞生存率檢測值

Tab.2 Survival rate of six groups of hypertrophy cardiomyocytes

表2 6組肥大心肌細胞生存率檢測值

組別劑量/(μmol·L-1)細胞存活率/%正常對照組…96.78±0.47模型對照組…79.69±0.38?1哌唑嗪組5092.64±0.32?2DHBF 低濃度組1081.56±0.29?1 中濃度組2589.61±0.57?1?2 高濃度組5094.72±0.34?2F57.362P<0.05

與正常對照組比較，*1P<0.05 ；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05； compared with model control group，*2P<0.05

2.2DHBF對NE誘導的心肌細胞c-jun和BNP的mRNA表達的影響 RT-PCR 檢測分析結果見表3。與正常對照組比較，模型對照組心肌肥大標志物c-jun和 BNP mRNA表達均上調，分別增加2.14和2.57倍(n=6，P<0.05)；與模型對照組比較，DHBF低、中、高濃度組心肌肥大標志物 c-jun和 BNP mRNA表達均明顯下調(P<0.05)。結果表明DHBF可阻斷由NE誘導的心肌細胞c-jun和 BNP mRNA的表達增高。

2.3DHBF對NE誘導的肥大心肌細胞內CaN、NFAT-3蛋白表達水平的影響 Western blotting 蛋白檢測結果見圖1，表4。與正常對照組比較，模型對照組 CaN、NFAT-3蛋白表達均升高(P<0.05)；與模型對照組比較，DHBF低、中、高濃度組CaN、NFAT-3蛋白表達明顯下降(P<0.05)，結果表明DHBF可抑制由NE誘導的心肌細胞CaN、NFAT-3的蛋白表達。

2.4DHBF對NE誘導的肥大心肌細胞表面積的影響 各組心肌細胞橫截面積見圖2，表5。與正常對照組比較，模型對照組心肌細胞表面積明顯增大(P<0.05)；與 模型對照組比較，哌唑嗪組及DHBF低、中、高濃度組心肌細胞表面積明顯縮小(均P<0.05)。結果表明DHBF可減小由 NE 誘導的心肌細胞表面積的增加。

表3 6組肥大心肌細胞c-jun和BNP的mRNA表達

Tab.3 The mRNA expression of of c-jun and BNP in six groups of hypertrophy cardiomyocytes

表3 6組肥大心肌細胞c-jun和BNP的mRNA表達

組別c-junBNP正常對照組1.00±0.011.00±0.01模型對照組3.14±0.32?13.57±0.62?1哌唑嗪組1.73±0.44?21.75±0.41?2DHBF 低濃度組2.53±0.28?12.61±0.53?1 中濃度組1.60±0.26?1?21.81±0.33?1?2 高濃度組1.11±0.2?21.07±0.38?2F11.81910.988P<0.05<0.05

與正常對照組比較，*1P<0.05 ；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05； compared with model control group，*2P<0.05

A.正常對照組；B.模型對照組；C.哌唑嗪組；D.DHBF低濃度組；E.DHBF中濃度組；F.DHBF高濃度組

圖16組肥大心肌細胞CaN、NFAT-3蛋白表達

A.normal control group；B.model control group；C.prazosin group；D.low-dose DHBF group；E.medium-dose DHBF group；F.high-doseDHBF group

Fig.1ProteinexpressionofCaNandNFAT-3insixgroupsofhypertrophycardiomyocytes

3 討論

在發達國家，1%～2%成人患心力衰竭，而在 70 歲以上人群，該比例高達10%[8]。BROUWERS等[9]報道，心力衰竭發生后，男性和女性患者5年生存率分別為25%和38%。近年來，經過包括利尿藥、血管緊張素轉換酶抑制藥、β 受體阻斷藥、醛甾酮受體阻滯藥等藥物優化治療和心臟再同步化治療等綜合治療后，心力衰竭患者預后較前改善，住院率下降，但仍不容樂觀。目前認為，心臟重構是心力衰竭發生發展的基本機制，因而對心臟重構學說的研究不斷深入。心臟肥厚是心臟重構的重要環節，其誘發因素有高血壓、心肌梗死、瓣膜病等，在細胞形態學方面主要表現為心肌細胞體積增大，蛋白合成增加，并伴有心肌細胞凋亡、心肌纖維化等；心肌肥厚最初是心臟對高負荷的適應性反應，但是持續的心肌肥厚將會導致心律失常、心力衰竭和心臟驟停[10]。因此，阻斷心肌肥大是干預心力衰竭的重要策略。

表4 6組肥大心肌細胞內CaN、NFAT-3蛋白表達

Tab.4 Protein expression of CaN and NFAT-3 in six groups of hypertrophy cardiomyocytes

表4 6組肥大心肌細胞內CaN、NFAT-3蛋白表達

組別濃度/(μmol·L-1)CaNNFAT-3正常對照組…0.67±0.110.62±0.10模型對照組21.27±0.28?11.18±0.21?1哌唑嗪組500.76±0.15?20.73±0.14?2DHBF 低濃度組100.98±0.19?10.96±0.21?1 中濃度組250.83±0.13?1?20.81±0.16?1?2 高濃度組500.71±0.09?20.67±0.07?2F8.3317.468P<0.05<0.05

與正常對照組比較，*1P<0.05 ；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05； compared with model control group，*2P<0.05

心肌肥大是一種由多種因素參與調節的復雜動態過程，現已證實磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶通路、鈣調神經磷酸酶通路、MAPK 通路[11]、NO/cGMP 通路等多條信號通路均參與其病理過程[12]。其中，NE是體內一種重要的神經遞質和內分泌激素，可促進心肌細胞肥大，在心肌肥厚、心力衰竭等病理過程中起重要作用，而這些病理過程往往伴有心肌細胞的異常生長、凋亡及氧化應激的增加[13]。近來許多研究表明，氧化應激產生的活性氧 (ROS)，在亞毒劑量時可充當第二信使分子，可以調節轉錄因子活化、細胞凋亡、細胞生長等生理過程。同時ROS通過調節信號轉導過程中的多個環節，完成功能性應答：ROS對于 Ca2+信號轉導、蛋白激酶與蛋白激酶的磷酸化及轉錄因子均有一定的作用。有研究發現NE可作為一種內在的氧化劑，促使氧化應激的發生，在高血壓、糖尿病等疾病的心臟損害中發揮重要作用。這些均為研究 DHBF對NE誘導心肌肥厚的抑制作用提供了可能的探討方向。

c-jun和 BNP 是心肌合成和分泌的多肽，屬于胚胎基因，主要在心臟發育期表達，在出生之后通常低表達或者不表達。心肌肥厚時，c-jun和BNP mRNA 的表達代償性增加，因此可以作為心肌細胞肥大的重要標志物[14]。肥大的心肌細胞客觀上表現為心肌細胞體積明顯增加，顯微鏡下可觀察到細胞表面積增加；心肌細胞胚胎基因重新表達，c-jun和 BNP mRNA上調是心肌細胞肥大的標志。本課題前期研究發現，DHBF可降低腎血管性高血壓大鼠血壓，可改善左室收縮舒張功能和心肌收縮力，其機制可能與降低血循環、心肌組織、腎組織中內皮素 (endothelin，ET)水平，升高一氧化氮(NO)水平，調整體內ET與NO平衡狀態有關[5]。本研究發現與對照組比較，模型對照組c-jun和BNP的mRNA水平顯著升高，證明肥大心肌細胞模型構建成功，DHBF明顯降低心肌細胞肥大標志物c-jun和BNP的mRNA表達水平，并呈劑量依賴性，提示DHBF對NE誘導的心肌肥大有一定抑制作用。

心肌肥厚的發生是多因素、多靶點、多條細胞內信號轉導通路共同促進、共同參與所致的病理生理過程。細胞內Ca2+濃度濃度升高是內外界刺激誘導心肌肥厚發生發展中的中心環節[15]。當細胞內Ca2+濃度持續增加，可活化很多肥厚相關基因的表達，CaN/NFAT 是鈣離子介導的一條主要信號傳導通路，在心肌肥厚的發生發展過程中起著至關重要的作用[16]。各種刺激均能導致細胞內Ca2+濃度升高，游離的 Ca2+與鈣調素結合，共同參與鈣調神經磷酸酶的激活，而活化的 CaN 又會進一步磷酸化細胞質中的活化 T 細胞核因子(NFAT)，磷酸化的 NFAT 可以透過細胞核膜，與細胞核內的鋅指轉錄因子(GATA4)結合，共同促使心肌肥厚相關基因ANP、BNP等胎兒型基因的表達，進而使心肌蛋白合成增加、心肌細胞橫截面積增大、成纖維細胞增生，最終導致心肌肥厚的發生[17]。本研究發現與NE誘導的心肌肥大模型組比較，DHBF 可明顯降低心肌細胞的 CaN、NFAT 的蛋白表達水平，提示DHBF對NE誘導的心肌肥大的抑制作用可能與Ca2+介導的CaN-NFAT信號傳導通路有關。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.哌唑嗪組；D.DHBF低濃度組；E.DHBF中濃度組；F.DHBF高濃度組

A.normal control group；B.model control group；C.prazosin group；D.low-dose of DHBF group；E.medium-dose of DHBF group；F.high-dose of DHBF group

Fig.2Microscopyofmyocardialcellsinsixgroupsofhypertrophycardiomyocytes(×200)

表5 6組肥大心肌細胞表面積

與正常對照組比較，*1P<0.05 ；與模型對照組比較，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.05； compared with model control group，*2P<0.05

在本研究中，筆者選用NE誘導原代心肌細胞肥大，排除血流動力學負荷和其他神經體液刺激等影響因素，是常用的評價心肌肥大的體外實驗模型，同時用NE 誘導原代培養的心肌細胞肥大，建立心肌肥大模型，并進一步觀察到DHBF能明顯增加由 NE 誘導的肥大心肌細胞的存活率、抑制心肌肥大標志物c-jun和BNP的mRNA表達和CaN、NFAT的蛋白表達，以及減小肥大心肌細胞表面積，提示DHBF對肥大心肌細胞有明顯的抑制和保護作用。其次，本研究中采用臨床常用治療心肌肥厚藥物哌唑嗪和DHBF進行干預，發現所選3個濃度的 DHBF 對心肌細胞肥大的抑制作用呈現濃度依賴性，以50 μmol·L-1DHBF抑制作用最強。哌唑嗪是臨床上用于治療心肌肥厚的常用藥物，在本研究中發現高濃度DHBF在抑制心肌肥厚的作用方面優于哌唑嗪，說明DHBF具有開發價值。因本研究采用的心肌細胞部分為原代培養的乳鼠心肌細胞，而與乳鼠心肌細胞相比，成年鼠心肌細胞更接近疾病發生的內環境。所以本研究僅在在細胞層面驗證DHBF下調由NE誘導的心肌細胞肥厚，如果能在成年鼠心肌細胞上進行研究，實驗設計將會更加嚴謹。

綜上所述，DHBF能夠抑制去甲腎上腺素誘導的心肌細胞肥大，對心肌細胞有一定的保護作用，這可能與其抑制Ca2+介導的CaN-NFAT信號傳導通路有關，此作用為其有可能成為臨床防治心力衰竭的潛在藥物提供了依據。