黃芩苷誘導小鼠結腸癌發生壞死性凋亡作用的體外研究*

楊愛霞，吳彪，何偉，胡必成，黃鶴歸，徐蕾，張力凡

(武漢市第一醫院1.藥學部；2.胃腸外科；3.實驗中心，武漢 430022)

結直腸癌是全球發病率最高的三大常見癌癥之一[1]，發病率呈現逐年上升的趨勢[2]。目前的治療方法主要有手術切除、輔助化療和放射治療(放療)等[3]。研究者們發現一些藥物能夠通過誘導腫瘤細胞發生壞死性凋亡達到廣譜抗腫瘤作用。壞死性凋亡(necroptosis)是區別于壞死和凋亡的一種新的死亡方式，是非Caspase依賴的程序性死亡，在腫瘤和心血管、神經退行性疾病[4-5]的發生發展中有著重要意義。黃芩苷具有明顯的抗腫瘤作用，可以通過多途徑來產生抗腫瘤作用[6-7]，包括抗癌、抗炎、抗氧化和神經保護等[8-11]。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類化合物[12]，具有明顯的抗癌作用。筆者通過體外實驗觀察黃芩苷誘導結腸癌細胞發生壞死性凋亡，為黃芩苷臨床抗腫瘤應用提供實驗依據。報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器 流式細胞儀(德國Leica公司，型號：FACSVantage SE)；激光共聚焦熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號：TCS SP5)；倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司，型號：IX71)、照像系統(日本 OLYMPUS公司)；QPCR設備(Funglyn Biotech公司，型號：FTC2000)；Western blotting設備(BIO-RAD公司) ；二氧化碳(CO2)培養箱(日本三洋公司)；多功能酶標儀(美國 Thermo Fisher公司)；細胞培養瓶及細胞培養板購于美國Costar公司；PHILIPS TECNAI-10透射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)。

1.2試劑 黃芩苷購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110715，含量：93.3%，使用二甲亞砜(DMSO)配制成濃度為100 μmol·L-1的溶液。RPMI 1640 培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，北京中杉公司)； DMSO(美國Amresco公司)；CCK-8試劑盒(貨號：96992)購于美國Sigma公司；碘化丙啶(PI，貨號：ST511)、DAPI(貨號：C1006) 染色液、抗熒光淬滅劑均購于上海碧云天生物技術有限公司；一抗：RIP3(兔來源)(貨號：ab62344)、內參一抗β-actin(兔來源)購于美國Abcam公司；二抗：羊抗兔購于美國IgGAbcam公司。 z-VAD-fmk(Caspases抑制劑，貨號：187389-52-2)。

1.3細胞株 小鼠結腸癌細胞CT26.WT細胞系，購于中國科學院上海細胞庫。

1.4細胞培養及分組 將細胞培養于含10%優質胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，2～3 d換液1次，細胞80% 融合度時傳代，可按照1∶3傳代比例進行，于37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養箱中培養。細胞分組：①正常對照組，加入新鮮培養基，常規培養；②黃芩苷組，加入100 μmol·L-1黃芩苷；③ z-VAD-fmk組，加入20 μmol·L-1z-VAD-fmk抑制劑；④聯合用藥組，加入終濃度為 20 μmol·L-1z-VAD-fmk1 h后加入100 μmol·L-1黃芩苷，繼續培養72 h后收集樣本作為藥物模型(100 μmol·L-1黃芩苷)進行后續檢測。

1.5CCK8法檢測CT26.WT細胞存活率 收集生長狀態良好的CT26.WT細胞，計數調整細胞濃度至1×105·mL-1，每組細胞設復孔3個，將96孔板移入培養箱中培養，孵育過夜，使細胞完全貼壁。將96孔板移入培養箱中培養(37 ℃，5%CO2)，培養適當時間(24，48，72 h)。每孔加入CCK-8溶液10 μL，于培養箱內孵育4 h。用多功能酶標儀測定在450 nm處吸光度值。z-VAD-fmk預處理>1 h，將黃芩苷與抑制劑聯合使用，加入96孔板中再進行檢測。

細胞活力(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%，細胞抑制率(%)=1-細胞活力。

1.6PI單染流式細胞術(FCM)檢測細胞死亡率 將處于對數生長期的CT26.WT細胞用6孔板培養，待細胞生長達到60%～70%，吸出舊培養基，按上述分組加藥分別再繼續培養8，16，24，32 h后，把細胞培養液吸出至合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶過度消化，加入之前收集的細胞培養液，混勻，轉移到離心管內，1000×g離心5 min，棄去上清液，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。加入PI染色液10 μL，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。

1.7用DAPI染色檢測CT26.WT細胞核的變化 細胞經過洗滌，在培養板中將已制備完成的細胞爬片用1×PBS浸洗3次，每次3 min；固定：用4%多聚甲醛(PBS配制)常溫固定細胞爬片15 min。洗滌：1×PBS浸洗細胞爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干殘留較多的PBS。染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，1×PBS浸洗爬3次，每次3 min，洗去多余DAPI。用吸水紙吸干爬片上的殘留PBS，用含抗熒光淬滅劑封片；然后在激光掃描聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8透射電鏡觀察CT26.WT細胞死亡形式 將固定好的組織樣本做透射電子顯微鏡觀察組織細胞內的細胞器形態變化。透射電子顯微鏡由華中科技大學電子顯微鏡室提供技術支持。對CT26.WT細胞進行擴大培養，待細胞生長增殖良好，并有8個10 cm2瓶皿70%細胞量時，對細胞分組，分別進行以上加藥處理72 h。收集：將細胞用胰酶消化，調整濃度為(1～5)×105·mL-1，轉移到EP管中，3000 r·min-1(有效離心半徑10 cm)離心3 min，棄去上清液。依次用4 ℃，2.5%戊二醛2 h，1%四氯化鋨25～30 min進行固定，用PBS洗2遍，每次10 min，將固定的細胞團塊移入滅菌的青霉素小瓶中。再依次用50%，70%丙酮溶液各1次，90%丙酮2次，100%丙酮3次，每次12 min，進行脫水。棄去殘余脫水劑，室溫下依次加入丙酮-EPON812包埋劑3～4 mL，維持30 min、純包埋劑1～2 mL，反應2 h，進行完全包埋。在60 ℃烤箱下烘烤24 h，混合包埋劑包埋的樣品直至固化為包埋硬塊。用超薄切片機將標記好包埋硬塊切為厚度約1 μm的半薄切片。經干燥、染色、再次切片、形成薄膜、再染色，用醋酸雙氧鈾染色液及鉛染色液于室溫下各染色10，12 min，沖洗并用濾紙吸干后用透射電子顯微鏡仔細觀察樣品細胞的超微結構。

1.9QPCR法檢測細胞RIP3 mRNA的變化 將分組細胞勻漿：對于貼壁生長的細胞，可將培養基棄除后，直接將總RNA提取劑TRIzol試劑加到培養板中。每10 cm2加入TRIzol試劑1 mL，用微量加樣吸頭反復吹打勻漿，直至細胞全部溶化。將上述勻漿液室溫放置5 min，待核酸和蛋白充分解離。每毫升TRIzol 試劑用量的勻漿液中加入三氯甲烷0.2 mL，蓋緊管蓋，手動劇烈震搖15 s，然后室溫靜置2～3 min。4 ℃，10 000 r·min-1(有效離心半徑10 cm)離心10 min。將上清液棄除，每管加入75%乙醇1 mL潤洗，蓋緊管蓋，輕輕晃動試管，以去除殘留的異丙醇和鹽份。4 ℃ 7 500 r·min-1(有效離心半徑10 cm)離心5 min。將上清液棄除，打開管蓋，將RNA 沉淀干燥(室溫揮發或真空干燥)。將RNA 沉淀溶解于適量(20～50 μL)的無RNase水中。QPCR法檢測各組RIP3mRNA表達水平。CT值表示每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。△Ct=目的基因Ct-內參基因Ct，相對表達量=2(-△Ct)，相對比值=目的基因相對拷貝數/內參基因相對拷貝數。

1.10Western blotting 法檢測CT26.WT細胞壞死性凋亡相互作用蛋白RIP3蛋白表達 總蛋白提?。杭毎呀赓N壁細胞，棄掉培養基，用PBS洗1次。懸浮細胞，收集細胞離心，PBS洗1次。通常每106個細胞加細胞組織快速裂解液RIPA緩沖液0.1 mL。裂解液和細胞充分接觸冰上放置，用槍頭輕輕吹打，使細胞充分裂解。再輕輕傾斜培養皿，然后將其轉移到1.5 mL離心管，劇烈振蕩30 s。4 ℃，12 000 r·min-1(有效離心半徑10 cm)，離心15 min，吸取上清液，電泳。電壓80 V跑過濃縮膠后轉換至120 V，待溴酚藍跑至膠板底部剛好沒有跑出即可。將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、PVDF膜(經甲醇活化)、濾紙、海綿墊；同時將電泳液換成轉移液。將電流調整到恒流200 mA，轉移1～3 h。取出膜，并做好正反面標記，在TBST中清洗1 min，然后用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h。用封閉液將對應一抗稀釋成一定的濃度(1：500)，內參一抗的稀釋終濃度為1：1000，然后溫育1.5 h或4 ℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次5 min。用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1：1000)，然后溫育1.5 h。用TBST清洗4次，每次5 min。曝光。將電致化學發光(electrochemilu-cminesence，ECL)曝光液按A液：B液1：1混勻后均勻覆蓋在整片膜上，反應2 min，放入曝光儀曝光檢測。

2 結果

2.1黃芩苷對小鼠結腸癌細胞CT26.WT的增殖抑制作用 隨著黃芩苷濃度的增加和作用時間的延長，CT26.WT細胞的存活率明顯降低(圖1)。黃芩苷濃度為100 μmol·L-1時，24，48，72 h細胞存活率分別為(93.58±1.25)%，(78.55±6.31)%和(44.60±4.89)% 。實驗中將100 μmol·L-1作為后續實驗中所用的濃度。在Caspase抑制劑處理 >1 h后，加用黃芩苷100 μmol·L-1處理72 h細胞的存活率，與正常對照組比較，黃芩苷組和聯合用藥組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.2CT26.WT細胞的死亡率 PI染色結果顯示：黃芩苷處理不同時間后各組細胞死亡情況，正常對照組細胞死亡率為(10.54±0.19)%；與對照組比較，黃芩苷組死亡率為(34.93±0.16)%，明顯上升；與黃芩苷組比較，聯合用藥組死亡率為(23.27±1.20)%，明顯降低(P<0.01)，即Caspase抑制劑降低黃芩苷的作用，抑制劑處理過的細胞死亡比例明顯下降。z-VAD-fmk組細胞死亡率為(11.23±0.59)%，與聯合用藥組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3CT26.WT細胞核的改變 細胞進行DAPI染色后，用熒光顯微鏡觀察結果顯示，DAPI染色呈藍白色熒光。正常對照組與z-VAD-fmk組細胞核呈淺藍色，均勻淡染；與正常對照組比較，黃芩苷組核濃染，出現碎裂現象；與黃芩苷組比較，聯合用藥組核濃染，有更加明顯核碎裂現象。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察CT26.WT細胞圖像見圖3。

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯合用藥組；與正常對照組比較，*1P<0.01；與z-VAD-fmk組比較，*2P<0.01

A.normal control group；B.baicalin group；C.z-VAD-fmk group；D.baicalin+z-VAD-fmk group；Compared with normal control group，*1P<0.01； Compared with z-VAD-fmk group，*2P<0.01

2.4CT26.WT細胞超微結構的變化 用透射電子顯微鏡觀察結果表明，與正常對照組比較，黃芩苷作用后細胞的超微結構明顯改變，細胞破裂。線粒體腫脹、細胞內容物外泄；與黃芩苷組比較，聯合用藥組細胞略顯皺縮，染色質邊聚，線粒體腫脹程度減弱。透射電鏡觀察CT26.WT細胞藥物處理后超微結構改變見圖4。

2.5細胞RIP3 mRNA的表達 熒光定量PCR檢測結果顯示，與對照組比較，單獨使用黃芩苷與聯合抑制劑處理細胞均能顯著上調其mRNA表達(P<0.01)，說明黃芩苷可以上調細胞的RIP3 mRNA的表達；而抑制劑可以減弱RIP3的基因表達作用(P<0.01)。黃芩苷與聯合使用Caspase抑制劑z-VAD-fmk對RIP3 mRNA表達的改變見圖5。

2.6CT26.WT細胞RIP3蛋白表達量 Western blotting結果顯示，與正常對照組比較，黃芩苷可以明顯激活RIP3蛋白的表達；聯合用藥也可以激活RIP3蛋白的表達，而作用弱于黃芩苷；z-VAD-fmk組RIP3蛋白的表達減弱，黃芩苷組、z-VAD-fmk組與聯合用藥組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

3 討論

壞死性凋亡是一種與壞死具有相似的形態學特征，細胞體積及胞內細胞器腫脹，包膜完整性破壞，內容物外泄，且為非Caspases 依賴性的程序性細胞死亡，即在泛Caspases 抑制劑(z-VAD-fmk)的條件下，死亡受體與配體的結合可觸發壞死性凋亡。 RIP3 是誘導細胞壞死過程所必需的，而RIP1只有在 RIP3 存在的條件下才能發揮誘導細胞壞死的作用，在非Caspase酶依賴性的細胞壞死中起重要作用。壞死性凋亡的調節涉及一系列分子的表達與活化，RIP3在此過程中發揮重要的作用[13-14]。

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯合用藥組

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯合用藥組

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯合用藥組；與黃芩苷組比較，*1P<0.01；與z-VAD-fmk組比較，*2P<0.01

A.normal control group；B.baicalin group；C.z-VAD-fmk group；D.baicalin+z-VAD-fmk group；Compared with baicalin group，*1P<0.01； Compared with z-VAD-fmk group，*2P<0.01

采用CCK-8法檢測細胞活性的改變，經過不同處理的4組樣品，結果差異有統計學意義，提示黃芩苷可以誘導結腸癌細胞的死亡；分析方法中采用流式細胞法檢測細胞的凋亡情況，源于現有報道中反映黃芩苷能夠誘導細胞凋亡。凋亡的發生均有Caspase酶的參與，因此采用廣譜Caspase抑制劑作為對照，易于觀察出區別于細胞的形態和指標的變化，區別凋亡和壞死性凋亡的發生。本研究顯示，黃芩苷在誘導細胞凋亡的同時，細胞也發生區別于凋亡的死亡方式。為證明細胞在藥物處理后細胞核也發生的變化，本實驗中采用DAPI對細胞核直接染色，隨后在熒光顯微鏡下觀察，經過黃芩苷處理過的細胞，細胞核濃染，出現明顯的核碎裂現象。采用透射電子顯微鏡觀察細胞質中線粒體的形態改變，線粒體發生明顯的壞死特征，腫脹明顯，并有內容物外泄，這是區別于凋亡的關鍵特點。RIP3是壞死性凋亡最關鍵的標志性蛋白，通過QPCR和WB法檢測到它的基因和蛋白的表達明顯增加。

A.正常對照組；B.黃芩苷組；C.z-VAD-fmk組；D.聯合用藥組；與黃芩苷組比較，*1P<0.05；與z-VAD-fmk組比較，*2P<0.05

圖64組細胞RIP3蛋白條帶與蛋白表達情況

A.normal control group；B.baicalin group；C.z-VAD-fmk group；D.baicalin+z-VAD-fmk group；Compared with Baicalin group group，*1P<0.05； Compared with z-VAD-fmk group，*2P<0.05

Fig.6ProteinbandsandproteinexpressionofRIP3infourgroupsofcells

經過上述實驗：從細胞形態上，細胞膜、細胞質的線粒體、細胞核都發生形狀的改變；以及壞死性凋亡受體相互作用蛋白RIP3水平發生明顯的變化。由于本課題尚未完成，關于線粒體膜電位、ATP水平、LDH水平將在后續實驗中逐步完善。因此，可以初步推斷黃芩苷誘導小鼠結腸癌細胞發生了壞死性凋亡，且發現在聯合使用Caspase抑制劑z-VAD-fmk時，黃芩苷誘導壞死性凋亡水平有所降低。因此，筆者認為：經黃芩苷處理后的細胞在發生凋亡的同時，也發生壞死性凋亡。

隨著對壞死性凋亡研究的深入，在腫瘤對化療藥物引導的細胞凋亡產生抵抗情形下，研究者將治療腫瘤的方向逐漸轉向藥物誘導腫瘤細胞壞死性凋亡，并發現一些藥物能夠通過誘導腫瘤細胞發生壞死性凋亡達到抗腫瘤作用。多種癌癥研究中均發現，黃芩苷可以通過多條途徑產生抗腫瘤作用。通過本研究加深了對細胞死亡方式的理解和認識，為后續研究奠定基礎，也為黃芩苷在凋亡抑制或抵抗的情況下，在臨床抗腫瘤應用提供了實驗依據。