大鼠灌胃不同晶型來曲唑的藥動學*

宋俊科，邢逞，龔寧波，張雯，孫加琳，呂揚，杜冠華

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所1.天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室；2.藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室；3.晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

多晶型是固體有機化合物普遍存在的一種現(xiàn)象，藥物晶型的差異不僅影響藥物物質成分的穩(wěn)定性，而且會影響藥物的治療效果[1-3]。來曲唑(letrozole)是新一代芳香化酶抑制劑，為人工合成的芐三唑類衍生物，其通過抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，從而消除雌激素對腫瘤生長的刺激作用[4-6]。來曲唑存在多種晶型[7]，比較不同來曲唑晶型之間的藥動學特點，對于保證藥物的臨床療效具有重要意義[8]。筆者在本實驗建立SD大鼠血漿中來曲唑含量測定的反相高效液相色譜法，并分析不同晶型來曲唑經消化道固體給藥后大鼠體內藥動學的差異。

1 材料與儀器

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠，雄性[9-11]，體質量230～270 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK(京)2006-0009。

1.2藥品與試劑 來曲唑晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(Ⅲ為無定形態(tài))由中國醫(yī)學科學院藥物研究所呂揚教授提供(含量≥99%)，3種晶型固體物質的粉末X射線衍射圖譜見圖1。卡馬西平(中國醫(yī)學科學院藥物研究所藥物分析室制備，含量≥99%)，甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，純凈水(娃哈哈公司)。

1.3儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；高速冷凍離心機(美國Beckman公司)；Eppendorf離心機(德國Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2漩渦混勻器(上海凡勁儀器設備有限公司)；Eppendorf移液器(德國Eppendorf公司)。

2 方法與結果

2.1溶液的配制

2.1.1對照品溶液的配制 精密稱取來曲唑對照品1 mg，加入甲醇充分溶解并混勻，配成1 mg·mL-1來曲唑母液，然后以流動相依次稀釋成不同濃度的標準溶液。

A.來曲唑晶型Ⅰ；B.來曲唑晶型Ⅱ；C.來曲唑晶型Ⅲ(Ⅲ為無定形態(tài))

圖1來曲唑3種晶型固體物質的粉末X射線衍射圖譜

A.Letrozole crystal form Ⅰ； B.Letrozole crystal form Ⅱ； C.Letrozole crystal form Ⅲ (amorphous form)

Fig.1PowderX-raydiffractionspectrogramofthreeletrozolecrystalforms

2.1.2內標溶液配制 精密稱取卡馬西平1 mg，加入流動相1 mL充分溶解并混勻，配成1 mg·mL-1卡馬西平母液，以流動相稀釋成100 μg·mL-1的內標溶液。

2.2色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(40：60)；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：239 nm；進樣量：20 μL[12-15]。

2.3血漿樣品處理

2.3.1空白血漿處理方法 精密吸取大鼠空白血漿100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入乙酸乙酯800 μL，震蕩3 min，12 100×g離心10 min，取上層有機相，在室溫下氮氣(N2)吹干，用流動相100 μL復溶，震蕩3 min，12 100×g離心10 min，進樣20 μL。

2.3.2血樣處理方法 精密吸取大鼠血漿100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內標工作液10 μL，渦旋混勻。然后按照“2.3.1”中方法處理，進行HPLC分析。

2.4專屬性考察 在實驗所采用的HPLC條件下，來曲唑和卡馬西平的保留時間分別為7.9和6.0 min，見圖2。來曲唑和內標峰形良好，在保留時間范圍內均沒有內源性物質或其他物質的干擾，基線噪音較小，可滿足定量測定要求。

A.空白血漿；B.空白血漿配制標準樣品；C.給藥大鼠血漿樣品；1.卡馬西平；來曲唑

圖23種血漿樣品的HPLC圖

A.bank plasma；B.blank plasma spiked with letrozole and IS；C.rat plasma sample after oral administration of letrozole spiked with IS；1.carbamazepinz；2.letrozole

Fig.2Typicalchromatogramsofthreekindsofplasmasamples

2.5標準曲線的繪制及最低定量限的確定 分別配制來曲唑濃度為0.25，0.5，1.25，2.5，5，6.25，12.5，25，50 mg·L-1的系列血漿，按照“2.3”項血樣處理方法處理樣品，在相應色譜條件下進行測定，重復5次，以來曲唑峰面積(As)與卡馬西平峰面積(Ai)的比值(Y)對來曲唑濃度(X)作線性回歸，得標準曲線：Y= 0.24X-0.006 4，R2=0.999 5(n=9)，表明來曲唑在0.25～ 50 mg·L-1內線性關系良好。本方法定量限為0.25 mg·L-1，此濃度下信噪比大于10，并且其與加樣濃度比較的偏差在±20%范圍內。

2.6萃取回收率 分別配制來曲唑濃度為0.5，5和50 mg·L-1的血漿樣品，按照“2.3.2”項下血樣處理方法處理，進行HPLC分析，記錄峰面積，計算萃取回收率。重復5次，結果見表1。來曲唑在3個濃度條件下回收率分別為100.87%，93.30%和102.41%，其RSD分別為3.14%，7.26%和5.90%，表明本法提取回收率良好，適合目標化合物的測定。

表1 來曲唑在大鼠血漿中的回收率

Tab.1 Recovery of letrozole in rat plasma

表1 來曲唑在大鼠血漿中的回收率

藥物加樣濃度/(mg·L-1)回收率RSD%來曲唑0.5100.87±3.173.14593.30±6.777.2650102.41±6.045.90卡馬西平5094.07±2.772.94

2.7精密度和準確度實驗 分別配制來曲唑濃度為0.5，5和50 mg·L-1血漿樣品，按照“2.3.2”項下的血樣處理方法處理，進行HPLC分析。結果見表2。來曲唑測定的日內精密度RSD<4.75%，日間精密度RSD<5.68%，日內準確度偏差的絕對值<4.84%，日間準確度偏差的絕對值<2.12%，提示該方法準確、可靠、重復性好，符合新藥臨床前藥動學研究生物樣品定量分析的要求。

表2 來曲唑在大鼠血漿中的精密度與準確度

Tab.2 Intra-day and inter-day accuracy and precision of letrozole in rat plasma

表2 來曲唑在大鼠血漿中的精密度與準確度

加樣濃度/(mg·L-1)日內精密度測定濃度/(mg·L-1)RERSD%0.50.48±0.02-4.844.7554.98±0.12-0.422.505052.30±1.514.602.89加樣濃度/(mg·L-1)日間精密度測定濃度/(mg·L-1)RERSD%0.50.51±0.021.203.5954.89±0.18-2.123.615049.51±2.81-0.975.68

2.8穩(wěn)定性實驗 為考察來曲唑的穩(wěn)定性，將配制好的血漿樣品分別在自動進樣器放置12 h、室溫放置4 h、30 d內凍融3次、和-20 ℃凍存30 d后再進行測定，從而確定測定方法的穩(wěn)定性。結果見表3。各處理條件的分析結果RE均在±15%范圍內，表明方法穩(wěn)定性較好。

表3 方法穩(wěn)定性考察

Tab.3 Stability test of the method

表3 方法穩(wěn)定性考察

處理條件與加樣濃度/(mg·L-1)測定濃度/(mg·L-1)RERSD%自動進樣器放置12 h 0.50.57±0.0214.832.75 55.39±0.117.812.04 5053.52±1.047.031.95室溫放置4 h 0.50.56±0.0212.312.99 55.32±0.136.312.47 5054.81±2.479.624.51凍融3次 0.50.56±0.0311.185.38 55.33±0.146.682.70 5054.83±2.499.674.55-20 ℃凍存30 d 0.50.54±0.068.6111.75 55.33±0.136.602.51 5054.92±2.469.834.48

2.9藥動學研究 將18只SD大鼠隨機分為3組，每組6只，于給藥前12 h禁食不禁水，按100 mg·kg-1固體灌胃，于給藥后0.5，1，2，3，5，6，7，9，12，14，24，30，37，48 h于眼內眥取血置肝素化管中，離心取上清液100 μL，然后按照“2.3.2”處理方法處理后，進行測定并繪制藥-時曲線，見圖3。利用藥動學統(tǒng)計分析軟件DAS 3.0.7，采用非房室模型進行藥動學參數的計算并采用one-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，結果見表4，大鼠灌胃來曲唑晶型Ⅰ、晶型Ⅱ和晶型Ⅲ后，血液中來曲唑Cmax分別為(9.247±4.612)，(23.387±9.049)和(15.682±1.589) mg·L-1，AUC0→t分別為(198.115±47.014)，(476.641±125.467)和(271.817±41.068) mg·L-1·h。

3 討論

本實驗通過對大鼠灌胃來曲唑晶型后血藥濃度進行監(jiān)測，得到各個晶型藥動學參數。來曲唑晶型Ⅱ、Ⅲ的Cmax較晶型Ⅰ分別高156%和78%，晶型Ⅱ的AUC0-t和AUC0-∞較晶型Ⅰ和Ⅲ分別高141%，77%和75%，103%，說明口服來曲唑晶型Ⅱ可能會有更好的體內吸收情況，有效血藥濃度更高。另外，晶型Ⅰ平均滯留時間(MRT0-t和MRT0-∞)較晶型Ⅱ和Ⅲ分別高5%，33%和82%，219%，可能是由于晶型Ⅰ的吸收比較滯后，導致其初始血藥濃度較低和末端血藥濃度較高，最終造成MRT增大。此外，晶型Ⅰ表觀分布容積(Vz)高于晶型Ⅱ和Ⅲ，分別高333%與167%，這也可能與其吸收滯后的效應相關，或存在其他未知的影響因素。清除率結果顯示，與晶型Ⅱ比較，晶型Ⅰ和晶型Ⅲ分別高114%與101%，這提示晶型Ⅱ相比其他晶型清除率更低，這也從側面解釋其血藥濃度最高的原因。以上研究結果表明，不同來曲唑晶型口服給藥后，AUC0-t、AUC0-∞和Cmax存在著一定的差異，其中晶型Ⅱ可能為來曲唑的優(yōu)勢晶型。

表4 SD大鼠灌胃來曲唑多晶型(100 mg·kg-1)后藥動學參數

Tab.4 Pharmacokinetic parameters after oral administration of letrozole crystal forms (100 mg·kg-1) in rats

表4 SD大鼠灌胃來曲唑多晶型(100 mg·kg-1)后藥動學參數

晶型AUC0-tAUC0-∞(mg·L-1·h)Ⅰ198.115±47.014?1319.468±217.254?2Ⅱ476.641±125.467564.812±111.664Ⅲ271.817±41.068?1277.817±42.301?1晶型MRT0-tMRT0-∞hⅠ20.058±4.57250.514±63.902Ⅱ19.148±5.15327.676±24.623Ⅲ15.085±1.98316.011±2.529晶型t1/2tmaxhⅠ30.193±43.9714.500±7.688Ⅱ10.749±13.35215.833±10.61Ⅲ7.266±1.3589.167±1.602晶型Vz/F/(L·kg-1)CLz/F/(L·kg-1·h)Cmax/(mg·L-1)Ⅰ10.391±7.208?20.392±0.15?19.247±4.612?1Ⅱ2.444±2.3930.183±0.03423.387±9.049Ⅲ3.845±0.9340.368±0.06?215.682±1.589

與晶型Ⅱ比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with crystal form II，*1P<0.01，*2P<0.05