粉末X射線衍射技術(shù)定量分析左炔諾孕酮晶型*

邢逞，曹俊姿，張麗，龔寧波，楊世穎，杜冠華，呂揚(yáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所1.晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

左炔諾孕酮(levonorgestrel)是一種速效、短效口服避孕藥，可以抑制排卵并阻止孕卵著床，同時(shí)使宮頸黏液濃度增大，阻止精子前進(jìn)[1]，從而達(dá)到避孕的目的，是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的緊急避孕固體藥物。除用于緊急避孕之外，左炔諾孕酮還被報(bào)道用于乳腺癌患者子宮內(nèi)膜的保護(hù)[2]和子宮內(nèi)膜異位癥的囊腫治療[3]。目前該藥物及其制劑收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版二部[4]。左炔諾孕酮存在多晶型現(xiàn)象，目前國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)專利報(bào)道左炔諾孕酮存在3種晶型物質(zhì)，包括晶α型、晶β型、晶γ型[5-9]，其中晶γ型為臨床藥用晶型，鑒于左炔諾孕酮3種晶型在一定條件下會(huì)互相轉(zhuǎn)化，且左炔諾孕酮藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未涉及晶型質(zhì)控問(wèn)題，故筆者對(duì)左炔諾孕酮的臨床藥用晶型開展定量分析研究[10-11]。

美國(guó)食品藥品管理局針對(duì)仿制藥的研發(fā)趨勢(shì)，發(fā)布了《仿制藥晶型研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[12]。提出了評(píng)價(jià)建立多晶型質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的必要性，也為原料藥多晶型和藥物制劑多晶型質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了指導(dǎo)性建議。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的藥物晶型定量分析方法主要有粉末X射線衍射(powder X-ray diffraction，PXRD)法[13]、差示掃描量熱法[14]、固態(tài)核磁共振法、傅里葉變換紅外光譜法等。其中PXRD法是最經(jīng)典、非破壞性、較準(zhǔn)確的晶型定量方法，且PXRD法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于晶型的定量分析和結(jié)晶度的測(cè)定，目前已納入到《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則“藥品晶型研究及晶型質(zhì)量控制指導(dǎo)原則”[4]中。PXRD法定量分析的理論基礎(chǔ)是物質(zhì)參與衍射的體積或重量與其產(chǎn)生的衍射強(qiáng)度成正比。因而，可以通過(guò)衍射強(qiáng)度的大小求出參與衍射的體積或質(zhì)量[15-16]。

通過(guò)對(duì)市售左炔諾孕酮原料藥及制劑進(jìn)行晶型鑒別及重現(xiàn)專利晶型的制備方法確證了目前左炔諾孕酮的臨床藥用晶型為晶γ型。采用單晶X射線衍射法(single crystal X-ray diffraction method，SXRD)技術(shù)方法獲得了晶γ型純品的定量數(shù)據(jù)，通過(guò)理論計(jì)算獲得其晶態(tài)晶型純度為100%的樣品標(biāo)準(zhǔn)PXRD數(shù)據(jù)；采用PXRD法分析制備的左炔諾孕酮晶γ型，發(fā)現(xiàn)其粉末X射線衍射圖譜與PXRD圖譜一致，表明實(shí)驗(yàn)制備的粉末樣品為左炔諾孕酮晶γ型純品；采用PXRD分析技術(shù)建立了左炔諾孕酮晶γ型的晶型含量定量檢測(cè)方法，該方法制樣簡(jiǎn)便，分析快速，對(duì)樣品無(wú)破壞性，晶型含量測(cè)定準(zhǔn)確可靠，研究結(jié)果對(duì)左炔諾孕酮的晶型質(zhì)量控制提供了有效分析技術(shù)方法和科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器與實(shí)驗(yàn)條件

1.1.1SXRD法 日本理學(xué)Rigaku MicroMax 002+單晶X射線衍射儀。實(shí)驗(yàn)條件為采用CuKα輻射(1.54187 ?)，共聚焦單色器，準(zhǔn)直光管直徑ф=0.30 mm，晶體與CCD探測(cè)器距離d=45 mm，管壓45 kV，管流0.88 mA。結(jié)構(gòu)解析和結(jié)構(gòu)精修采用Shelxs-97完成。

1.1.2PXRD法 日本理學(xué)Rigaku D/max-2550 PXRD儀。實(shí)驗(yàn)條件為采用石墨單色器，CuKα輻射(1.54184 ?)，管壓為40 kV，管流為150 mA，掃描步長(zhǎng)為0.02°，掃描速度為8°·min-1，發(fā)散狹縫為1°，接收狹縫為0.15 mm，防散射狹縫為1°，掃描范圍為3°～80°。實(shí)驗(yàn)樣品均經(jīng)研磨，并過(guò)100目篩，精密稱量后進(jìn)行檢測(cè)。

1.1.3天平 瑞士梅特勒公司XS105型分析用，感量0.01 mg。

1.2試藥 左炔諾孕酮原料樣品購(gòu)于南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司和武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，化學(xué)純度均>99.0%。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1晶型樣品制備

2.1.1晶γ型單晶培養(yǎng) 采用甲醇-四氫呋喃(0.5：1)重結(jié)晶，室溫約25 ℃條件下靜置6 d，得到無(wú)色透明塊狀晶體。

2.1.2晶γ型樣品制備 取左炔諾孕酮原料藥樣品1 g，加入乙醇125 mL，溶解完全后于室溫重結(jié)晶，40 ℃減壓干燥2 h，得到白色粉末狀樣品。

2.2晶型確證

2.2.1SXRD法 采用SXRD法獲得左炔諾孕酮晶γ型的晶體學(xué)數(shù)據(jù)，晶體屬正交晶系，空間群為P212121，晶胞參數(shù)：a=6.581(3)?，b=12.812(3)?，c=20.680(5)?，晶胞體積V=1 743.7(10)?3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z=4。左炔諾孕酮晶γ型的立體結(jié)構(gòu)投影圖和晶胞堆積圖見圖1。

圖1晶γ型的立體結(jié)構(gòu)投影圖(A)和晶胞堆積圖(B)

Fig.1ORTEPdiagram(A)andpackingimage(B)oflevonorgestrelformγ

左炔諾孕酮化合物分子骨架由3個(gè)六元環(huán)和1個(gè)五元環(huán)構(gòu)成。晶態(tài)下分子內(nèi)不存在氫鍵聯(lián)系，分子間的氫鍵聯(lián)系為O2…O1(-x+1/2，-y，z+1/2)：2.933?。晶態(tài)下分子以氫鍵作用力和范德華力維系其在空間的穩(wěn)定排列。SXRD法研究使用一顆單晶體，故該研究數(shù)據(jù)，結(jié)果能體現(xiàn)該種晶型樣品100%晶型純度結(jié)果。

2.2.2PXRD法 利用左炔諾孕酮的晶γ型樣品的SXRD數(shù)據(jù)，通過(guò)理論計(jì)算可獲得晶型純品的理論P(yáng)XRD圖譜。左炔諾孕酮晶γ型的理論和實(shí)驗(yàn)PXRD圖譜見圖2。左炔諾孕酮晶γ型前10位主強(qiáng)峰比對(duì)數(shù)據(jù)見表1。

圖2左炔諾孕酮晶γ型粉末X射線衍射圖譜

Fig.2PXRDpatternsoflevonorgestrelformγ

采用PXRD法對(duì)制備的左炔諾孕酮晶型樣品分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左炔諾孕酮晶γ型的PXRD圖譜數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)值與理論數(shù)據(jù)一致，表明實(shí)驗(yàn)制備的粉末樣品為晶γ型純品。

2.3定量分析

2.3.1特征衍射峰的選取及專屬性研究 按照PXRD定量分析的特征峰選取原則：①選取目標(biāo)成分具有特征性的獨(dú)立衍射峰；②特征衍射峰的絕對(duì)強(qiáng)度應(yīng)與目標(biāo)成分含量呈線性關(guān)系；③強(qiáng)度較高的衍射峰應(yīng)優(yōu)先選擇。預(yù)選取了左炔諾孕酮晶γ型6個(gè)衍射峰(d=5.6，6.1，6.4，4.5，4.2和3.8 ?)作為定量分析的特征峰，見圖3。

表1 左炔諾孕酮晶γ型理論與實(shí)驗(yàn)PXRD圖譜前10位主強(qiáng)峰數(shù)據(jù)對(duì)比

圖3左炔諾孕酮晶γ型的PXRD圖譜(3°～40°)

Fig.3PXRDpatternsoflevonorgestrelformγ(3°-40°)

2.3.2線性與范圍 精密稱取左炔諾孕酮晶γ型樣品5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 mg，每種質(zhì)量樣品平行制備2組，對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行PXRD分析。晶γ型的6個(gè)特征衍射峰絕對(duì)強(qiáng)度(CPS)見表2。

以晶γ型質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以d=6.4，6.1，5.6，4.5，4.2，3.8?處衍射峰的絕對(duì)峰強(qiáng)度平均值為縱坐標(biāo)，依次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性方程分別為Y=459.59X+5 536.5(R2=0.993 0)、Y=432.58X+6 827.6(R2=0.990 9)、Y=615.95X+6 209.5(R2=0.990 8)、Y=232.61X+4 118.7(R2=0.961 7)、Y=189.31X+3776.1(R2=0.949 0)、Y=126.79X+2 738.4(R2=0.929 4)，線性范圍均為5～50 mg。

分析結(jié)果表明，左炔諾孕酮晶γ型6個(gè)特征衍射峰中的d=6.4，6.1，5.6 ?的絕對(duì)強(qiáng)度與質(zhì)量間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.99)，因此d=6.4，6.1，5.6 ?的3個(gè)衍射峰均可作為其含量測(cè)定的特征峰使用，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可實(shí)現(xiàn)對(duì)晶型原料藥質(zhì)量控制目的。

2.3.3中間精密度(儀器精密度) 精密稱取左炔諾孕酮晶γ型樣品50 mg，共1份，進(jìn)行PXRD分析，測(cè)定6次，考察d=6.4，6.1，5.6 ?處衍射峰絕對(duì)峰強(qiáng)時(shí)精密度，RSD值分別為0.86%，0.75%，0.96%，均<2.0%，表明利用PXRD測(cè)定左炔諾孕酮晶γ型含量的檢測(cè)分析方法具有良好的中間精密度。

表2 PXRD法測(cè)定晶γ型結(jié)果

2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取左炔諾孕酮晶γ型樣品50 mg，共6份，分別測(cè)定1次，考察檢測(cè)方法的精密度，計(jì)算獲得6份樣品在d=6.4，6.1，5.6 ?處絕對(duì)峰強(qiáng)的RSD值分別為1.25%，1.45%，1.76%，均<2.0%，表明利用PXRD測(cè)定左炔諾孕酮晶γ型含量的檢測(cè)分析方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.5樣品測(cè)定 分別取廠家1與廠家2的左炔諾孕酮原料藥，過(guò)孔徑0.150 mm(100目)篩，精密稱取50 mg各3份，在相同的測(cè)試條件下測(cè)定PXRD圖譜，記錄d=6.4，6.1，5.6 ?的特征衍射峰的絕對(duì)強(qiáng)度值，分別代入回歸線性方程，計(jì)算左炔諾孕酮樣品中晶γ型質(zhì)量平均值分別為49.8和50.0 mg，含量分別為99.6%和100%。表明市售的廠家1與廠家2的左炔諾孕酮原料藥為晶γ型純品。

3 討論

筆者在對(duì)左炔諾孕酮市場(chǎng)應(yīng)用現(xiàn)狀的調(diào)研以及其多晶型考察中發(fā)現(xiàn)，左炔諾孕酮3種晶型物質(zhì)中晶γ型為臨床使用的藥用晶型。故采用PXRD分析的單峰法為左炔諾孕酮的原料藥建立晶型定量分析方法。單峰法靈敏度較高，方法簡(jiǎn)單便捷，但是該方法需要標(biāo)準(zhǔn)品，或者要求標(biāo)樣具有較高的晶型純度，而且制樣時(shí)產(chǎn)生的擇優(yōu)取向效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重影響單峰法的應(yīng)用。根據(jù)左炔諾孕酮晶γ型的晶體學(xué)數(shù)據(jù)，計(jì)算出的理論P(yáng)XRD圖譜數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)粉末完全吻合，表明制備的粉末樣品為晶γ型純品，可作為標(biāo)準(zhǔn)樣品使用。制樣時(shí)，統(tǒng)一將樣品研磨過(guò)孔徑0.150 mm(100目)篩，減少擇優(yōu)取向效應(yīng)對(duì)峰強(qiáng)度值的干擾。

利用PXRD法建立的定量分析方法，線性關(guān)系良好，且具有良好的中間精密度和重復(fù)性。此方法的建立可以實(shí)現(xiàn)對(duì)左炔諾孕酮原料藥中晶型成分進(jìn)行質(zhì)量控制，為提高現(xiàn)有左炔諾孕酮藥品標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)藥品晶型控制，完善晶型含量檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持，滿足我國(guó)各制藥企業(yè)左炔諾孕酮原料藥生產(chǎn)過(guò)程中的晶型質(zhì)量控制要求。