泊洛沙姆188修飾聚乙烯亞胺作為基因載體的體外評價*

鄂曉，游慶霞，陳效，尹東鋒

(新疆軍區總醫院藥劑科，烏魯木齊 830000)

基因治療是將外源性的功能性治療基因遞送至靶細胞，取代缺陷、突變的基因，或調節目的蛋白的表達的一種療法。基因治療近二十年來得到廣泛的關注，據統計超過1800個基因治療的臨床實驗被批準[1]。基因治療為癌癥、人獲得性免疫缺陷綜合征、遺傳性疾病的有效治療帶來希望[2-4]。如何安全有效地將治療基因導入到目的細胞或組織是基因治療的關鍵。基因載體分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體具有很高的轉染效率，由于安全性的原因，包括免疫原性、插入突變性等問題，限制了病毒載體的臨床應用[5]。非病毒載體的轉染效率雖不及病毒載體，但具有易于制備、成本低、免疫毒性低等優勢，2004—2013年，使用非病毒載體的臨床實驗逐年增加，而使用病毒載體的卻顯著下降[6]。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)是最常用的非病毒載體之一，分子中含有高密度的胺基基團，可產生“質子海綿”作用，使PEI與DNA所形成的復合物從內涵體中逃逸出來，進入細胞核，表現出較高的轉染效率。PEI的轉染與其相對分子質量密切相關，隨著相對分子質量的增加，其轉染效率也增高，但其細胞毒性也隨之增大，同時PEI/DNA復合物膠體穩定性較差，易在體液環境中發生聚集，被網狀內皮系統所清除，限制PEI的臨床應用[7]。筆者在本研究使用泊洛沙姆188(poloxamer 188，P188)修飾高相對分子質量PEI，P188是兩親性嵌段共聚物，平均相對分子質量為8350，包含親水性的聚氧乙烯基團和疏水性的聚氧丙烯基團，毒性很低，作為乳化劑可靜脈使用，并顯著提高膠體的穩定性。文獻[8]報道采用平均相對分子質量為11 500的泊洛沙姆407，但P188相對分子質量小，與細胞親和力好，轉染相率相對較高，因此將P188末端羥基活化后，化學聯接到PEI分子上，考察其作為基因載體的可行性。

1材料與儀器

1.1細胞 MCF-7細胞(批號：161110)、HeLa細胞(批號：170122)、HepG2細胞(批號：160611)均購自南京凱基生物科技發展有限公司。于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM)中培養，培養基置于37 ℃、相對濕度90%、5%二氧化碳(CO2)的培養箱中。

1.2藥品與試劑 泊洛沙姆188(P188，德國BASF公司，批號160323)；PEI(美國Sigma-Aldrich公司，批號：171023)；4-甲氧基氯化三苯甲烷(上海韶遠科技有限公司，批號：R1411185)；三光氣(上海韶遠科技有限公司，批號：R1502028)；N-羥基琥珀酰亞胺(上海韶遠科技有限公司，批號：R1412263)；質粒DNA(KD，批號：170912)；噻唑藍(MTT，上海碧云天生物技術有限公司，批號：170628)；DMEM(Thermo公司，批號：171011)、磷酸鹽緩沖液(Thermo公司，批號：170818)；胎牛血清(Gibco公司，批號：170526)；胰蛋白酶(Thermo公司，批號170628)；二甲亞砜(DMSO，美國Sigma-Aldrich公司，批號：161223)；質粒pGL3(美國Promega公司，批號：170306)。

1.3儀器與設備 旋轉蒸發器(RE2000B，上海亞榮生化儀器廠)；納米粒度電位儀(Zetasizer Nano ZS90，英國馬爾文公司)；CO2培養箱(BC-J80S，上海博迅實業有限公司)；DNM-9602酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司)；磁共振波譜儀(型號：Mercury Plus 300MHz，美國Varian公司)；化學發光檢測儀(型號：GloMax 96，美國Promega公司)；凝膠成像分析系統(型號：Tanon 2500R，上海天能科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1方法

2.1.1PEI的修飾 P188約1 mmol(8.350 g)在50 ℃下真空干燥，溶解在無水吡啶40 mL中，加入4-甲氧基三苯基氯甲烷0.308 g(1 mmol)，在氮氣保護、25 ℃下磁力攪拌反應4 h，反應液旋轉蒸發后以二氯甲烷20 mL溶解，經硅膠柱純化，蒸干洗脫液得到淡黃色產物(收率78.3%)。

將上述產品(4.310 g，約0.5 mmol)以甲苯-二氯甲烷(3：1)混合溶劑40 mL溶解，加入三光氣0.149 g(0.5 mmol)，25 ℃下磁力攪拌，反應液經旋轉蒸發后以甲苯和二氯甲烷(2：1)的混合溶劑30 mL溶解，加入N-羥基琥珀酰亞胺0.060 g (0.5 mmol)和無水三乙胺0.071 mL(0.5 mmol)，磁力攪拌反應4 h，反應液濾過后，旋轉蒸發，再以二氯甲烷10 mL溶解，經過硅膠柱純化，得到產物(收率83.6%)。

將6份PEI 0.250 g(0.01 mmol)以10%乙醇溶液溶解，分別加入上述活化后的P188(0.01，0.02，0.05，0.1，0.2 mmol)，25 ℃下磁力攪拌，脫去保護基團，將反應液pH值調至中性，采用葡聚糖凝膠色譜柱分離純化產物，再使用超濾管(MWCO=10000)進一步純化，純化后的產物(收率52.7%)經冷凍干燥后置于-20 ℃下備用。將純化后的最終產物溶解到D2O中，進行1H-NMR分析。合成的新聚合物命名為(P188)1-PEI，(P188)2-PEI、(P188)5-PEI、(P188)10-PEI、(P188)20-PEI，其中下標數字1，2，5，10，20代表該聚合物中每個PEI聯接的P188的數目。

2.1.2凝膠電泳分析 取適量質粒DNA和PEI以及(P188)n-PEI分別以5%葡萄糖溶液(pH值7.5)溶解，配制成適當濃度，將聚合物溶液逐滴加入到等體積DNA溶液中，室溫孵育20 min，制成不同N/P值的復合物。將上述制得復合物分別上樣，進行電泳分析，電泳條件：1.0%瓊脂糖，1×TAE緩沖液，電壓100 V，電泳時間60 min。紫外透射儀觀察并攝像。

2.1.3復合物粒徑和Zeta電位測定 取上述制備的不同N/P值的復合物適量，加入超純水稀釋，使用納米粒度電位儀測定復合物的粒徑和Zeta電位。

2.1.4細胞毒性測定 分別將對數生長期的MCF-7細胞、HeLa細胞、HepG2細胞以每孔1.2×105個的密度接種到96孔板中，加入DMEM，每孔 1 mL，培養24 h，使細胞匯合度達到70%～80%。實驗前，吸去培養基，每孔加入不同N/P值為3，6，12，24，48的復合物20 μL，孵育6 h后換含有10%胎牛血清的DMEM，繼續培養24 h，吸去培養基，加入0.5 mg·mL-1MTT 100 μL，37 ℃孵育4 h。吸取上清液，加入DMSO200 μL，振蕩10 min，492 nm波長處測定吸收值(A)。以未經處理的細胞作為對照(100%)。細胞相對活性的計算公式為：細胞活性 (%)=A實驗/A對照×100%。

2.1.5體外轉染實驗 轉染前一天用0.25%胰酶消化HeLa細胞，均勻接種在24孔板上，每孔加入DMEM 1 mL，培養24 h，使HeLa細胞匯合度達到70%～80%。轉染前，換上無血清DMEM，加入新鮮配制的復合物100 μL，含pGL3-Control質粒3 μg，每種復合物平行實驗3次，輕輕搖動24孔板使復合物鋪勻，孵育4 h后換含有10%胎牛血清的DMEM，繼續培養。細胞轉染后48 h，棄去培養基，PBS漂洗2次，加冰浴的CCLR細胞裂解液100 μL覆蓋細胞，溫和振搖培養液15 min，收集裂解液，14 000 r·min-1離心5 min。取上清液5 μL，加入蟲熒光素測定液100 μL于化學發光測定小杯中，混勻，用蟲熒光素酶分析系統立即測定10 s內蟲熒光素酶活性的計數，其中計數用相對光單位(relative light unit，RLU)表示。BCA法測定裂解液中細胞蛋白總量，以此校正由于每孔細胞之間密度不同而導致的蟲熒光素酶表達量的差異，最終以每毫克細胞蛋白的相對光單位來表示蟲熒光素酶的活性。

2.2結果

2.2.1聚乙烯亞胺的修飾 P188修飾PEI時，首先將P188一端羥基使用4-甲氧基三苯基氯甲烷保護，再將另一端未保護的羥基活化成琥伯酰亞胺碳酸酯，與PEI的胺基端聯接，再經脫保護和凝膠色譜純化，得到新的陽離子聚合物，反應路線見圖1。新聚合物的典型1H-HMR譜見圖2。-CH2CH2O-的質子峰在δ3.5～3.9 ppm，-CH2CH2NH-的質子峰在δ2.8～3.5 ppm，-CH3的質子峰在δ1.2～1.3 ppm。根據1H-NMR譜中-CH2CH2O-(P188)和-CH2CH2NH-(PEI)的質子峰面積，計算新聚合物中兩者比例，結果見表1。

2.2.2凝膠電泳分析 帶有負電荷的DNA分子在電場作用和中性pH緩沖液條件下，可通過瓊脂糖凝膠從負極向正極泳動，當陽離子聚合物與DNA分子通過電荷作用牢固結合后，可阻滯DNA分子在凝膠中的遷移。圖3為不同N/P值時復合物的凝膠電泳阻滯圖，隨著PEI修飾度的增加，即每個PEI分子聯接P188數目的增多，(P188)n-PEI與DNA完全結合的N/P值也隨之增大。PEI/DNA，(P188)1-PEI/DNA和 (P188)2-PEI/DNA復合物在N/P值為3時，聚合物即可以完全結合DNA。而(P188)5-PEI/DNA，(P188)10-PEI/DNA，(P188)20-PEI/DNA復合物分別在N/P值為6，8，18時，P188-PEI才可以完全結合DNA，阻止其在瓊脂糖凝膠中的遷移。

2.2.3復合物粒徑和Zeta電位 復合物的粒徑及Zeta電位測定結果見表2和表3。隨著復合物N/P值的增加，復合物的粒徑有減小的趨勢，這是因為隨著PEI量的增加，對DNA的壓縮能力增強。高修飾度的(P188)n-PEI(n=5，10，20)所形成的復合物粒徑偏大，可能是因為對DNA的壓縮能力有所下降所致。未經修飾的PEI與DNA形成的復合物在N/P值為48時，可以觀察到明顯的聚集現象。復合物Zeta電位隨N/P值的增加而增加，這是因為隨著PEI量的增加正電荷增加所致。相同N/P值復合物的Zeta電位隨著P188修飾量的增加而減小，這是由于P188遮蔽PEI的正電荷所致。

2.2.4細胞毒性 復合物對細胞的毒性與細胞株有一定的依賴性，對MCF-7細胞毒性最大，HeLa細胞次之，HepG2細胞最小。隨著N/P值增加，復合物對3種細胞的毒性也增加。(P188)n-PEI與PEI相比，在低N/P值時即可顯著降低對3種細胞的毒性；高N/P N/P值時，高修飾的(P188)n-PEI(n=5，10，20)可顯著地降低細胞毒性。隨著(P188)n-PEI相對分子質量和親水性的增加，可以大大降低細胞毒性，特別是MCF-7細胞。P188對PEI的修飾可以顯著地降低其細胞毒性，這是因為使用表面活性劑P188對PEI修飾后可以屏蔽PEI表面的正電荷，可以降低細胞膜表面的電荷密度，避免細胞死亡。但是這種屏蔽作用會使復合物對細胞的親合力下降，可能會引起轉染效率降低。見圖4。

圖1 反應路線圖(n=1，2，5，10，20)

圖2 聚合物的1H-NMR譜

表1 聚合物的性質

2.2.5體外轉染實驗轉染實驗結果 見圖5，未經修飾的PEI在N/P=6時其轉染效率最佳，隨著N/P值的提高(N/P≥6)，PEI的轉染效率逐漸降低，特別是N/P=48時，轉染效率只有最佳轉染效率的2.5%。而(P188)n-PEI在N/P=3值時，轉染效率顯著較低；在N/P=12和N/P=24時，可以保持較高的轉染效率，特別是(P188)1-PEI其最佳轉染效率(N/P=24時)顯著高于PEI的最佳轉染效率(P<0.01)。特別是在高N/P值(N/P=48)時，(P188)n-PEI都顯現出較好轉染效率。

圖3PEI/DNA和(P188)n-PEI/DNA復合物不同N/P值時凝膠電泳圖

Fig.3GelelectrophoresisofPEI/DNAand(P188)n-PEI/DNAcompoundatvariousN/Pratio

表2 復合物在不同N/P值時的粒徑

Tab.2 Particle sizes of the compound of various N/P ratios

表2 復合物在不同N/P值時的粒徑

復合物N/P=6N/P=9N/P=12N/P=24N/P=48PEI164±31121±22106±16 268±41 8521±839(P188)1-PEI182±11190±22132±10 87±6 99±13(P188)2-PEI196±11214±12189±15 124±9 113±11(P188)5-PEI273±8240±13299±13 177±12 125±14(P188)10-PEI-314±15267±10 221±13 115±8(P188)20-PEI--- 277±18 185±12

“-”由于陰離子聚合物和DNA結合率低未檢測出

“-” not determined due to low binding of cationic polymer to DNA

表3 復合物在不同N/P值時Zeta電位

Tab.3 Zeta-potential of the compound at various N/P ratios

表3 復合物在不同N/P值時Zeta電位

復合物N/P=6N/P=9N/P=12N/P=24N/P=48PEI22.4±1.330.4±2.739.7±2.542.3±0.747.9±1.1(P188)1-PEI17.8±1.523.8±2.027.4±0.431.6±0.733.3±0.8(P188)2-PEI15.3±1.519.4±2.322.7±2.228.6±0.832.3±0.6(P188)5-PEI3.2±1.112.4±0.618.1±0.922.3±2.128.0±2.2(P188)10-PEI-4.6±1.77.4±1.215.3±2.117.2±1.623.5±1.3(P188)20-PEI-13.4±2.5-5.8±1.96.6±0.79.8±1.113.5±0.8

A.MCF-7細胞；B.HLa細胞；C.HepG2細胞

A： MCF-7 cells； B： HeLa cells； C： HepG2 cells

3 討論

筆者在本實驗先將非離子表面活性劑P188的一端羥基保護，采用琥珀酰亞胺酯法將另一端羥基進行活化，活化后的產物可以在溫和的條件下與PEI的氨基快速和充分地反應，最后脫去保護基團，得到新的聚合物(P188)n-PEI(n=1，2，5，10，20)，其在生理條件下比較穩定，不易發生水解。

本實驗制備的復合物的粒徑大多都在60～400 nm范圍內，大部分文獻所報道用于體內外轉染實驗的復合物粒徑均在此范圍[9-10]。復合物Zeta電位隨著N/P值的增加而增加，這是因為隨著陽離子聚合物用量的增加，復合物所帶正電荷也相應增加；在相同N/P值時，復合物Zeta電位隨著P188修飾量的增加而減小，這是因為較多的P188遮蔽PEI的正電荷。高的Zeta電位會造成較強的細胞毒性，這是因為復合物表面的正電荷聚集在細胞膜表面，引起細胞膜破裂。隨著N/P值的提高，復合物的細胞毒性隨之增加，PEI表現尤為明顯，而 (P188)n-PEI由于P188遮蔽了復合物的正電荷，其毒性顯著減小，特別是高修飾度的(P188)n-PEI(n=10或20)。

體外轉染實驗表明，PEI/DNA復合物在高N/P值(N/P=24，48)時，由于較高的細胞毒性，造成細胞的大量死亡，其轉染效率很低，而(P188)n-PEI /DNA復合物則在高N/P值時可以保持較高的轉染效率。對PEI的修飾，必須做好細胞毒性和轉染效率之間的平衡，修飾物可以遮蔽PEI表面的正電荷，降低復合物的Zeta電位，減小細胞毒性，同時減少了復合物被細胞的攝取，降低了轉染效率[11-12]。本實驗制備的(P188)1-PEI既降低了PEI細胞毒性又在高N/P值保持了很高的轉染效率，預期(P188)1-PEI可以攜帶更多量的基因進行體內轉染。