膽酸鈉片質量狀況及現行標準

郭江紅，王文晞，馬妮，胡遠華，姜紅

( 湖北省藥品監督檢驗研究院，武漢 430064)

動物膽汁作為藥物使用在中國已經有上千年歷史，具有清熱解毒、止咳平喘等功效[1]。膽汁酸是動物膽汁的主要有效成分，其主要結構是以環戊烷多氫菲為核心的二十四碳膽烷羧酸，不同動物分泌不同類型膽汁酸的臨床功效也不盡相同[2]。膽酸鈉系自牛或豬膽中提取的膽汁酸鹽的混合物。臨床上作為利膽藥，用于膽汁缺乏及膽囊炎等。膽酸鈉片是膽酸鈉制成的糖衣片。其不良反應主要為胃腸道反應和皮疹。國內企業最早于1995年獲得膽酸鈉及膽酸鈉片的批準文號。膽酸鈉片目前全國共有生產企業17家，批準文號18個；但大部分企業長期不生產；現行標準為中華人民共和國衛生部藥品標準二部六冊(生化藥品第一分冊)，標準中收載了化學與薄層色譜鑒別，崩解時限及含量測定(乙醚萃取稱重法)。國外尚無該品種上市。膽酸鈉片是國家評價性抽驗品種，筆者根據原國家食品藥品監督管理總局統一安排，參考文獻[3-12]報道，對抽取30批不同企業生產膽酸鈉片實施法定檢驗，并進行探索性研究，全面考察該品種的質量現狀及現行法定標準水平。

1 儀器與試藥

1.1儀器 液質聯用飛行時間質譜儀(Waters G2-S Q-TOF LC/MS)，TAS-986型原子吸收分光光度計，Mars微波消解儀、AG-135電子天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.1 mg)，DHG-9036A電熱恒溫鼓風干燥箱，AT7 Smart型智能溶出度儀，Evolution-300型紫外可見分光光度計，millipore超純水機，MATRIX-F 近紅外光譜儀。

1.2試藥 膽酸對照品(批號：10078-0013)、豬去氧膽酸對照品(批號：100087-200610)、鵝去氧膽酸對照品(批號：110806-200704)、牛磺鵝去氧膽酸對照品(批號：110846-200506)、熊去氧膽酸對照品(批號：100087-200610)、去氧膽酸對照品(批號：110724-200207)購自中國食品藥品檢定研究院；牛磺豬去氧膽酸(批號：079K0045)、牛磺熊去氧膽酸(批號：119K0052)購自Sigma公司；甘氨豬去氧膽酸(批號：TRC24-CF-57-3)、牛磺膽酸(批號：LF50N06)、甘氨鵝去氧膽酸鈉(批號：LJ20O26)等由企業提供。鈉離子標準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，唯一標識：13432-2，規格：1000 μg·mL-1)、硝酸(色譜純)。

2 方法與結果

2.1抽樣簡介 全國共有生產企業17家，批準文號18個；但大部分企業并未生產，所以僅抽取到2個生產企業30批次樣品，涉及2個批準文號；其中生產企業抽樣2批次，占樣品總數6.7%； 在藥品經營企業抽取27批次，占樣品總數90.0%；在醫療機構抽取1批次，占樣品總數3.3%。從抽取樣品的地域分布來看，膽酸鈉片分布在8省市自治區，其中，安徽、江蘇、上海最多，均為6批次。

2.2依據現行質量標準檢驗結果及分析 本次抽取樣品均按中華人民共和國衛生部藥品標準二部六冊(生化藥品第一分冊)檢驗，該標準出版于1998年，該品種標準一直未進行增修訂。檢驗項目比較簡單，主要包括：性狀、鑒別、崩解時限與含量測定等4項；30批次樣品均符合規定，合格率為100%。其中崩解時限規定“應在1 h內完全崩解”，30批次樣品的崩解時限為21～39 min；30批次樣品含量測定結果為69.6%～77.8%，均符合“本品含膽酸不得少于標示量的65%”的規定。

2.3探索性研究結果及分析 結合企業現場調研、質量標準現狀及檢驗情況，針對藥品的有效性、安全性及質量可控性等方面，開展了產品的來源、有效成分、鈉離子含量、溶出行為及安全性等方面探索性研究。

2.3.1種屬來源鑒別 膽酸鈉原料藥標準中規定“本品系自牛或豬膽中提取的膽汁酸鹽混合物”，但不同動物的膽汁中膽汁酸成分有較大差別。據文獻報道，豬膽汁中主要游離膽汁酸為豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸[4]，牛膽汁中主要游離膽汁酸為膽酸和去氧膽酸[5]。采用薄層色譜法對樣品中的膽汁酸成分進行初步分析，對動物來源的膽汁酸進行區分。

按照現行標準薄層色譜鑒別項下方法：取本品，除去包衣，研細，稱取約2 g，加水10 mL，振搖溶解，作為供試品溶液。精密稱取豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸對照品，分別加甲醇制成1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)，吸取上述溶液各2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-正丁醚-冰醋酸(8：5：5)為展開劑，展開后，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃干燥5 min。結果顯示：本次抽樣30批次樣品薄層色譜鑒別均檢測出豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的斑點，提示所用膽汁來源均為豬膽汁，薄層色譜圖見圖1。

1.豬去氧膽酸對照品；2.鵝去氧膽酸對照品；3.企業A樣品(20131201)；4.企業B樣品(130402)

圖1膽酸鈉片膽汁薄層色譜圖

2.3.2有效成分研究 本品名為膽酸鈉片，有效成分應為膽酸鈉，即3α，7α，12α-三羥基-5β-膽烷酸單鈉鹽，但該品種原料藥膽酸鈉項下描述為膽汁酸鹽混合物，與品種名稱不符，故采用Q-Tof LC/MS法對樣品中成分進行分析鑒定。

質譜分析條件：采用BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，130 ?)，流動相A為水(含0.01%甲酸)，B為乙腈，C為甲醇，按表1進行梯度洗脫，流速為0.6 mL·min-1，柱溫 35 ℃；檢測器采用質譜檢測器，離子源為ESI負離子模式，采集模式為MSE，相對分子質量為50～1200，Trap電壓50～60 V，椎孔電壓40 V。結果見圖2，表2。30批次膽酸鈉片所含已知膽汁酸成分由豬去氧膽酸、牛磺豬去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、牛磺鵝去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、牛磺石膽酸和甘氨石膽酸組成。此外，還含有兩種未知膽汁酸成分，經過查閱文獻和MassFragment軟件預測，推測其為牛磺5-氧代-3α，6α-二羥基-24-膽烷酸和甘氨5-氧代-3α，6α-二羥基-24-膽烷酸。兩家生產企業膽酸鈉原料均來自豬膽，所含膽汁酸成分一致。

表1 流動相梯度洗脫表 %

A：水(含0.01%甲酸)；B：乙腈；C：甲醇

圖2 膽酸鈉片總離子流圖

2.3.3各膽汁酸成分含量測定 采用上述LC-MS法對確證的膽汁酸鹽成分進行含量測定，分析不同廠家，不同批次樣品之間各組分含量差異。結果顯示：30批次膽酸鈉片總膽汁酸含量為39.6%～71.4%，兩家企業測定值范圍及均值見表3。企業B總膽汁酸含量明顯高于企業A，且批間含量差異較小，提示該生產企業從原料制備到制劑生產穩定性較好；30批次膽酸鈉片中，鵝去氧膽酸、甘氨牛磺結合鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸與甘氨牛磺結合豬去氧膽酸分別占總膽汁酸含量95.5%(企業A)和96.6%(企業B)，由于牛磺酸和甘氨酸結合型膽汁酸只是增加膽汁酸在體內的溶解度，他們的療效同游離膽汁酸一致，因此，本次抽樣涉及的兩家生產企業產品的有效成分均為豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。

表2 膽酸鈉片各膽汁酸成分信息表

表3 膽酸鈉片總膽汁酸含量測定結果 %

2.3.4樣品中鈉含量測定 本品為膽汁酸鈉鹽，現行標準中未對鈉離子進行控制，擬采用原子吸收分光光度法測定樣品中鈉離子。檢測波長：589.0 nm，狹縫寬度：0.5 nm，燈電流：5.0 mA，氣體：空氣-乙炔。在該條件下進行方法學實驗，當鈉離子對照品溶液濃度為0.2～2.0 μg·mL-1，吸收值與濃度呈良好線性，回歸方程為Y=3.003 6X-0.082 9，r=0.999 0；檢出限為0.01 μg·mL-1；連續測量6次，含量的RSD為0.37%，方法精密度良好；加樣回收率平均值為100.4%，RSD=1.7%(n=6)，表明該方法準確度較好。樣品測定結果顯示：30批次膽酸鈉片鈉離子含量為3.6%～5.6%，各生產企業測定值范圍及均值見表4。兩家生產企業鈉離子含量差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 膽酸鈉片鈉離子含量考察結果 %

2.3.5溶出行為研究 膽酸鈉片作為動物膽汁提取的多組分生化藥糖衣片，現行標準中并未設定溶出度檢查項，擬開展膽酸鈉片的溶出行為研究，通過比較不同企業樣品的溶出曲線，考察不同企業樣品內在質量的差異，評價工藝的一致性。

由于膽酸鈉在偏酸性的條件下不溶解，并且會析出絮狀沉淀，因此，選取水作為溶出介質；采用漿法，每分鐘75轉，210 nm為測定波長。采用自身對照法：取20片，研磨，置500 mL量瓶中，加水適量，超聲20 min使溶解，濾過，取續濾液適量，加水稀釋到每毫升含0.1 mg的溶液，作為自身對照。分別在15，30，45，60，75，135，195，255 min取樣測定溶出度并繪制溶出曲線。兩家生產企業樣品溶出曲線見圖3。結果顯示：兩家生產企業樣品在100 min后才達到溶出平臺，企業A樣品比企業B在前期溶出較為緩慢，在75 min時達到平臺，企業B樣品溶出較緩和。溶出曲線中累積溶出量，采用f2相似因子法評價曲線相似性。結果顯示，兩家生產企業樣品溶出行為不相似(f2<50.2)。提示兩家生產企業制劑工藝存在差異。

圖3 兩家企業膽酸鈉片溶出曲線圖

2.3.6安全性方面考察 膽酸鈉在提取過程中可能會有膽紅素、膽固醇等有機物的殘留，此外，動物飼養過程中因環境、飼料等因素可能造成的重金屬及其他有害物質的的蓄積，也需要嚴格控制。因此，采用高效液相色譜法對樣品中膽紅素與膽固醇殘留進行檢測[8]，30批次樣品均未檢出膽紅素殘留與膽固醇殘留。收集企業A生產的3批膽酸鈉原料藥，采用原子吸收分光光度法和原子熒光法對原料中汞(Hg)、砷(As)、鉛(Pb)等進行考察，3批次原料藥中汞、砷、鉛殘留總和在4 mg·kg-1內，具體見表5。

表5 3批膽酸鈉原料汞、砷和鉛含量檢測結果 mg·kg-1

3 討論

膽酸鈉片中有效成分應為膽酸鈉，該品種說明書中對該品種成分的描述為“膽酸鈉化學名：3α，7α，12α-三羥基-5β-膽烷酸”；但探索性研究結果表明，膽酸鈉片中未檢出膽酸鈉，主要成分為豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸以及其與甘氨酸、牛磺酸結合鈉鹽。膽酸鈉片適應證為利膽，用于膽汁缺乏及膽囊炎。文獻查閱發現不同種類的膽汁酸，除了具有利膽作用外，還有很多不同功效，如膽酸還具有解熱、鎮痛、抗炎的功效，豬去氧膽酸能降低三酰甘油，適用于Ⅰa或Ⅰb型高血脂癥、動脈粥樣硬化癥。本品實際是多組分膽汁酸藥品，因此其適應證應依據膽汁酸種類的不同重新修訂。建議生產企業更改制劑名稱，重新修訂說明書中成分、適應證等相關信息。

膽酸鈉原料藥系從牛或豬膽中提取獲得，為動物內臟來源的生化藥。動物內臟可能積累鉛、砷、汞等有害物質，因此在原料藥質量標準中應對有害元素進行控制，但原料藥現行標準中為對重金屬及其他有害物質未進行控制。建議在原料藥標準中增訂相關有害物質檢查項。膽酸鈉片現行質量標準包括鑒別，片劑相關檢查及含量測定，項目設置過于簡單，現行標準不能有效控制產品質量。①本品為豬膽汁或牛膽汁提取的膽汁酸鹽，現行質量標準并未設定相應的鑒別項對不同種屬來源動物進行區分；不同動物來源的膽汁中膽汁酸成分存在較大差異，而不同膽汁酸成分有著截然不同的臨床療效。建議標準中增訂對膽汁來源的控制，建立薄層色譜法，對牛和豬來源的膽汁酸進行鑒別。②本品為膽汁酸鈉鹽，現行標準中并未對鈉離子的含量進行控制，應建立原子吸收分光光度法對鈉離子進行控制。③現行標準中含量測定采用乙醚萃取稱重法，該方法專屬性較差，不能有效控制產品中各膽汁酸含量，目前《歐洲藥典》(EP8.0)中熊去氧膽酸有關物質檢查采用高效液相-示差法，能有效分離多種游離膽汁酸[13]，文獻報道有專屬性更強的方法可分析不同游離膽汁酸[14]，因此建議建立高效液相色譜等專屬性較強的方法進行含量測定。