血清鐵和鐵蛋白水平在海人酸誘導的大鼠癲癇模型中的意義

姚煥煥，路屹

癲癇是一種以自發(fā)性反復發(fā)作為特征的復雜性多因素疾病[1]。谷氨酸是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與其特異性受體結(jié)合而介導神經(jīng)元興奮性傳遞，其含量的異常升高可誘發(fā)癲癇發(fā)作。很多癲癇病人腦內(nèi)可見谷氨酸—谷氨酰胺循環(huán)異常[2-3]。海人酸(KA)是腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，目前已廣泛用于癲癇發(fā)作的研究，許多學者將KA腹腔注射或立體定向腦室內(nèi)注射應用[4-5]，誘導出的動物模型可出現(xiàn)類似于人類顳葉癲癇發(fā)作的臨床表現(xiàn)，同時腦內(nèi)還可見海馬硬化和形態(tài)改變，以及神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細胞活化等特征性病理的改變。鐵是生命體不可缺少的微量元素，參與多種生物代謝過程，如氧運輸、能量的生成、DNA及脂質(zhì)的合成等。人體內(nèi)鐵含量過多或過少都會影響各器官的正常功能活動。在兒童腦組織發(fā)育過程中，鐵缺乏嚴重將影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，引起兒童不可逆的行為和認知障礙[6]；而鐵過量時，會導致神經(jīng)元的降解死亡，誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂性疾病，例如帕金森病、阿爾茨海默病等[7]。目前有關癲癇的發(fā)病機制尚未明確，觀點不一，而對于鐵在癲癇及其病理生理意義的作用也知之甚少，本實驗選取KA誘導的與人類顳葉癲癇臨床表現(xiàn)及病理相似的癲癇動物模型，應用原子吸收光譜儀測定血清鐵，采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測定血清鐵蛋白含量，初步探究微量元素鐵與KA誘導的癲癇之間的關系。

1 材料

1.1實驗動物無特定病原體動物(SPF)級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量270～370 g，2015年10月購自蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院實驗動物房,2016年10月進行實驗動物的處置并進行研究，均完全符合實驗動物倫理學原則。

1.2藥品、試劑與儀器KA(合肥志宏生物技術(shù)有限公司，批號：H37022764)，水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，批號：H13024604)，地西泮(吉林濟邦藥業(yè)有限公司，批號：H14021957)，大鼠血清鐵及血清鐵蛋白試劑盒(合肥志宏生物技術(shù)有限公司，批號：S20083085)；Med4101生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠生產(chǎn))。Labsystems Finnpipette 100 μL單道移液器；Thermo 50 μL 8道移液器； HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；華東電子DG5033A酶標儀(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司)。

2 方法

2.1模型制備成年雄性SD大鼠30只，按照隨機數(shù)字表法分成模型組和對照組，每組15只。模型組大鼠經(jīng)腹腔一次性注射KA 10 mg/kg，對照組腹腔注射0.9%生理鹽水35 mg/kg。注射后連續(xù)監(jiān)測大鼠4～5 h，觀察是否有癇性發(fā)作并進行分級。給予持續(xù)癲癇性發(fā)作超過1 h的大鼠腹腔注射地西泮4 mg/kg，并給予皮下注射1 mL生理鹽水補液治療。癲癇性發(fā)作行為觀察，參照Racine標準，0級：無驚厥發(fā)作；Ⅰ級：面肉痙攣(其中包括咀嚼動作、抖動胡須、眨眼)，濕狗樣抖動；Ⅱ級：頸肌痙攣(表現(xiàn)為有節(jié)律性的點頭)；Ⅲ級：單側(cè)上肢陣攣；Ⅳ級雙側(cè)上肢陣攣，站立；Ⅴ級：跌倒，全身陣攣發(fā)作。其中Ⅰ～Ⅲ級屬于部分性發(fā)作，Ⅳ～Ⅴ級屬于全面性發(fā)作。

2.2腦電圖記錄每組按照隨機數(shù)字表法選取3只大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)進行麻醉。參照文獻[8]置電極，進行腦電圖描記。采用Medlab生物信息采集系統(tǒng)描記兩組大鼠腦電圖，紙速5 mm/s,時間常數(shù)0.2，濾波50 Hz,放大倍數(shù)2 000，連續(xù)描記5 min。動物喂養(yǎng)室溫22～25 ℃專門實驗室喂養(yǎng)2個月，按時給食物和水，每2 d取不同時段連續(xù)監(jiān)測1 h，記錄實驗動物的行為學表現(xiàn)和存活情況。

2.3標本采集分別于給藥前1周和給藥后2個月采用眼眶靜脈叢采血法采集靜脈血1 mL，離心，取上層血清。-30 ℃低溫冰箱保存。

2.4血清鐵測定標本解凍，每組標本取100 μL，在空白管中加入0.1 mL雙蒸水和0.3 mL鐵顯色劑；在標準管中加入0.1 mL的2 mg/L鐵標準應用液和0.3 mL鐵顯色劑；在測定管中加入0.1 mL血清和0.3 mL鐵顯色劑，混勻。將測定管于沸水中煮5～10 min，其余兩組不煮，冷卻離心，取0.2 mL上清液，分別置于96孔板中，按說明書測各孔吸光度光密度(OD)值，記錄各組數(shù)值，按照以下計算公式計算血清鐵含量：

2.5測定血清鐵蛋白將標本解凍后，每組標本各取40 μL待測。(1)試劑盒室溫環(huán)境放置45 min，輕輕搖勻。(2) 稀釋與加樣:取5個分別標記為N2、N3、N4、N5、N6的離心管，然后用稀釋液將標準品原液按照1/32、1/16、1/8、1/4、1/2倍數(shù)稀釋成5種不同濃度的標準品應用液。(3)加樣：先分成空白孔、標準孔、待測樣品孔三組，其中空白孔不加樣本、生物素標記的抗-FE抗體及鏈霉親和素-HRP；標準品孔中加入50 μL不同濃度的標準品，鏈霉親和素-HRP 50 μL(標準品中已事先整合好生物素抗體，故不需要另加)；待測樣品孔中加入40 μL的樣本，然后各加入10 μL的抗-FE抗體，50 μL的鏈酶親和素-HRP，按照要求加樣混勻后，蓋上封板膜后，于37 ℃環(huán)境溫育1 h。(4) 配液：以1∶20倍的比例稀釋濃縮洗滌液和新鮮醫(yī)用雙蒸水。(5)洗滌：棄去酶標板上層液體，甩干，將每孔加滿洗滌液，靜置1 min后棄去，重復洗滌5～8次，用吸水紙將酶標板輕輕拍干。(6) 顯色：每孔先后加入50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，混勻，37 ℃避光反應15～20 min。(7) 終止：分別于每孔加50 μL終止劑，此時可見藍色立即轉(zhuǎn)黃，即終止反應。(8) 測定OD。(9) 實驗數(shù)據(jù)計算：根據(jù)鐵蛋白試劑盒說明書計算樣本含量。

3 結(jié)果

模型組大鼠依次出現(xiàn)Ⅰ～Ⅴ級癇性發(fā)作，腦電圖出現(xiàn)大量癇性波，對照組無癇性發(fā)作，腦電圖描記無異常。模型組血清鐵、血清鐵蛋白含量分別為(3.502±0.475)mg/L、(29.229±1.912) μg/L，均明顯高于對照組的(2.408±0.760)mg/L、(23.449±1.711)μg/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=1.328、19.169，P=0.018 3、0.026 7)。給藥前對照組大鼠血清鐵和血清鐵蛋白含量分別為(2.474±0.412) mg/L、(23.107±6.684) μg/L，與模型組的(2.457±0.535)mg/L、(24.258±9.304)μg/L比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.632、5.184，P=0.786 1、0.591 0)。血清鐵、血清鐵蛋白與癲癇發(fā)作具有相關性，相關系數(shù)r=0.633、0.732(P=0.035 0、0.013 9)。

4 討論

癲癇是一種由多病因引起的復雜的神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，全世界約有7 000萬癲癇病人，癲癇的發(fā)病率、患病率和病死率隨年齡、地點和時間的不同而變化，現(xiàn)有的診斷及治療方法還不夠完善，癲癇嚴重損害病人身體健康，降低生活質(zhì)量，引起一系列的精神心理問題，給個人及社會帶來沉重負擔。癲癇病因復雜，發(fā)病機制尚未完全闡明，神經(jīng)元的異常放電可能與離子通道異常，神經(jīng)遞質(zhì)的合成，神經(jīng)細胞異常凋亡以及突觸聯(lián)系、遺傳及免疫等的異常有密切關系。臨床通過磁共振磁敏感加權(quán)成像(SWI)測量癲癇病人腦鐵含量時發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇病人大腦皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)鐵水平降低[9]，如黑質(zhì)、紅核、基節(jié)區(qū)，皮質(zhì)結(jié)構(gòu)鐵含量增加，腦鐵在皮質(zhì)及皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了再分配。此外，皮質(zhì)和基底節(jié)鐵水平受癲癇發(fā)作年齡、發(fā)作持續(xù)時間各種致病因素的影響。

癲癇動物模型的制備方法不一，主要包括電點燃和化學點燃，其中戊四氮、匹羅卡品、KA及青霉素為常用的四種化學點燃藥物，腦內(nèi)立體注射和腹腔注射是常見的化學誘導癲癇動物模型的用藥方法。其中一次性腹腔注射KA誘導的癲癇動物模型，與人類顳葉癲癇的行為學表現(xiàn)和病理變化相似，制備方法簡單，是目前較為常用的癲癇模型制備方法。李欣等[10]發(fā)現(xiàn)KA誘導的癲癇大鼠海馬區(qū)線粒體呼吸鏈復合物生理功能明顯下降，而鐵參與氧化呼吸鏈復合物的形成，鐵的異常可能與KA誘導的大鼠癲癇發(fā)作有關。同時已有證據(jù)表明腦內(nèi)鐵的改變和癲癇之間有密切聯(lián)系[11-12],將鐵或者氯化亞鐵注射至實驗動物大腦皮質(zhì)或海馬區(qū)，可導致實驗動物腦電和行為性癲癇發(fā)作，由此建立癲癇動物模型，同時在治療各種鐵過載疾病過程中，具有螯合鐵作用的姜黃素已被廣泛應用于臨床[13]，與此同時，在實驗動物的研究中，姜黃素能有效抑制通過腦內(nèi)鐵注射所誘導的癲癇動物模型的癲癇發(fā)作和進展[14]。

外傷性癲癇的發(fā)病機制與含鐵物質(zhì)沉積于腦組織引起的一系列病理變有緊密聯(lián)系[15]。鐵主要以游離及結(jié)合鐵的形式存在，鐵蛋白是廣泛存在于動物體內(nèi)的貯鐵蛋白，起貯存鐵的作用，腦內(nèi)鐵主要以鐵蛋白的形式存在，鐵蛋白在一定程度上反映體內(nèi)鐵水平。一方面，鐵代謝可以產(chǎn)生具有氧化毒性的自由基，而這些自由基可促進合成某些胍類復合物，這些胍類復合物通過對神經(jīng)細胞的興奮作用而導致癲癇發(fā)作。血腦屏障在維持腦內(nèi)鐵代謝平衡的過程中發(fā)揮重要[16]，Michalak等[17]的實驗可檢測到KA誘導的大鼠癲癇發(fā)作后血腦屏障的通透性增加，鐵參與多種生物膜的物質(zhì)合成和分解，當鐵過量沉積時，可破壞膜的物質(zhì)合成，從而改變膜的穩(wěn)定，對于血腦屏障的內(nèi)皮細胞緊密連接的穩(wěn)定產(chǎn)生威脅，破壞腦內(nèi)物質(zhì)平衡，從而誘發(fā)癲癇。

綜上所述，血清中的鐵含量可在一定程度上反映體內(nèi)鐵代謝水平，腦內(nèi)鐵主要以鐵蛋白的形式存在，鐵蛋白在一定程度上反映體內(nèi)鐵水平，該兩種檢測方法較為方便快捷，可為研究鐵與癲癇的關系及發(fā)病機制提供新見解，或許可以成為一個潛在的監(jiān)測癲癇的生物學標志物。本研究發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠血中存在鐵和鐵蛋白含量的升高，推測癲癇大鼠存在鐵和鐵蛋白代謝的異常，血清鐵和鐵蛋白的增高與SD大鼠癲癇發(fā)作有關，而SD大鼠癲癇發(fā)作腦脊液及腦內(nèi)鐵含量的變化是否與血液鐵含量的變化具有相關性有待于進一步探究[17]。