腺苷脫氨酶三種原核表達載體的構建及蛋白表達*

韓麗喬，張 露，林海標，黃小亭，吳新忠，黃憲章，莊俊華

(廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州 510120)

腺苷脫氨酶(ADA)是機體一種重要的核酸代謝關鍵酶，在體內催化腺嘌呤核苷(脫氧腺嘌呤核苷)不可逆的脫氨，最終生成尿酸的反應[1]。ADA還可參與機體的免疫應答，誘導T細胞依賴的單核細胞分化為巨噬細胞并刺激其增殖，缺乏將導致重癥聯合免疫缺陷等[2-3]。ADA在臨床多種疾病的診斷和鑒別診斷中具有重要應用價值，如結核性、化膿性、病毒性胸腹水、腦脊液的鑒別診斷等[4-8]。因此，腺苷脫氨酶的準確定量在臨床檢驗中較為重要。目前關于酶的定量都是基于酶在單位時間內催化1 μmol底物的轉化速率來評估其活性，但影響其測量因素較多，如檢測溫度、底物濃度、反應體系pH等，而且目前國內尚無ADA的參考物質，國外BOTA等[9]報道的參考物質從紅細胞中提取獲得，需要耗費大量的原材料，且過程復雜，價格昂貴，因此本課題組利用成熟的分子生物學技術，同時構建了3種ADA原核載體(pET-28b+ADA，pET-32a+ADA，pHSIE+ADA)分別在大腸桿菌BL21(DE3)中進行腺苷脫氨酶蛋白的誘導表達，選擇最優，進而用于ADA參考物質的研究。

1 材料與方法

1.1材料 逆轉錄試劑盒(Fermentas 公司)，質粒小提試劑盒(北京康為世紀公司)，DNA回收試劑盒(OMEGA公司)，KOD-Plus高保真聚合酶試劑盒(TOYOBO公司)，限制性內切酶Ecor 1、Nco1、Xho1、Hind Ⅲ及T4 DNA連接酶(Takara 公司)，氨芐霉素、卡那霉素(北京鼎國)，IPTG、CaCl2、Tris、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、EDTA、硼酸(sigma)，酵母提取物和胰蛋白胨(OXOID公司)，瓊脂粉(上海生工)，瓊脂糖(invitrogen公司)，以及Western-blot相關試劑及設備(Bio-Rad)。3種原核質粒分別是pET-28b,pHSIE和pET-32a，前兩種由清華大學深圳研究生院生命科學院饋贈，pET-32a、大腸桿菌DH5α克隆菌株和BL21(DE3)表達菌株，為本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1目的基因序列獲取與引物合成 從pubmed基因庫查得人腺苷脫氨酶基因序列[Homo sapiens adenosine deaminase (ADA)，mRNA][10]。 根據目的基因和3種原核克隆載體(pET-28b，pET-32a，pHSIE)的序列及插入位點信息，每個載體合成一對引物，分別為：P1：5′-CCA TGG CCC AGA CGC CCG CCT TCG AC -3′(Nco1酶切位點) P2：5′- CTC GAG GAG GTT CTG CCC TGC AGA -3′ (Xho l酶切位點)； P1：5′- GAA TTC GCC CAG ACG CCC GCC TTC GAC -3′(Ecor 1酶切位點) P2：5′- AAG CTT TCA GAG GTT CTG CCC TGC AGA -3′ (Hind Ⅲ酶切位點) ；P1：5′- GAA TTC GCC CAG ACG CCC GCC TTC GAC -3′(Ecor 1酶切位點) P2：5′- AAG CTT TCA GAG GTT CTG CCC TGC AGA -3′ (Hind Ⅲ酶切位點)，加粗部分為內切酶序列，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2基因提取及目的基因擴增 用Trizol方法從健康成年人的白細胞中提取總mRNA，進一步逆轉錄合成cDNA。 再以cDNA為模板，分別大量擴增設有不同內切酶位點的目的基因，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定擴增結果并分別切膠回收，純化PCR產物并用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度。

1.2.3目的基因和質粒的剪接 分別將目的基因和空載質粒于內切酶的酶切條件下水浴雙酶切，經凝膠電泳鑒定后切膠回收。將酶切好的目的基因和3種質粒分別用T4連接酶于16 ℃過夜連接。

1.2.4構建重組克隆載體并進行陽性菌落鑒定 用CaCl2法制備DH5α感受態，將重組質粒加入含有DH5α感受態的溶液中，于冰上30 min，隨后42 ℃水浴鍋中準確熱擊90 s，立即于冰上2 min，再加入37 ℃預熱的無抗菌藥物的LB培養基，于37 ℃，220 r/min振蕩培養約1 h，均勻涂于含抗菌藥物的LB培養皿中，倒置于37 ℃，培養過夜。根據各自抗性，篩選陽性克隆菌，并進行菌落PCR鑒定。將PCR鑒定陽性單菌落接種于含相應抗菌藥物的LB培養基，37 ℃，220 r/min振蕩培養過夜，進行小量擴增。第二天提取質粒，將質粒溶液收集到離心管中，取少量進行酶切驗證。

1.2.5構建重組表達載體 將酶切驗證陽性的克隆質粒(pET-28b+ADA，pET-32a+ADA，pHSIE+ADA)分別轉化入BL21(DE3)表達菌，抗菌藥物初步篩選，挑取陽性菌落培養擴增后送測序鑒定。

1.2.6目的蛋白誘導表達及鑒定 將測序正確的陽性克隆菌株5 μL接種到含相應抗菌藥物的LB培養基5 mL中，37 ℃，220 r/min振蕩培養過夜。培養過夜的陽性克隆菌株1 mL接種到含相應抗菌藥物的99 mL LB培養基中，培養2.0～2.5 h，至OD600=0.6～0.8，加入不同濃度IPTG(0.4、0.8、1.0 mmol/L)，分別于誘導0、3、6、12、24 h后取樣，加入SDS 蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸10 min，使蛋白充分變性后于-80 ℃凍存待測。Western-blot 或SDS-PAGE對蛋白進行定性和半定量分析。

1.2.7目的蛋白活性初步鑒定 按照篩選的ADA蛋白表達條件，小量表達目的蛋白。將表達菌液、菌液超聲破壞菌體后液體，在羅氏生化分析儀初步檢測目的蛋白的活性。

2 結 果

2.1目的基因擴增結果 目的基因(約1 100 bp)擴增后分別經瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 000 bp上方有清晰條帶，與預期相符，見圖1A、B。

2.2陽性克隆菌落鑒定結果 挑選不同載體的陽性菌落，進行菌落PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在1 000 bp上方有明顯清晰條帶，與目的條帶(1 100 bp)相符，見圖2。

注：A中M為DNA Ladder DL2000， 1、2、3分別為pET-28b、pET-32a、pHSIE不同引物擴增的目的基因產物(1 100 bp)；B中M為DNA ladder DL5000，1、2為pET-32a空載質粒(5 900 bp)，3、4為pET-28b空載質粒(5 369 bp)，5為擴增的ADA序列(1 100 bp)

圖1腺苷脫氨酶PCR擴增基因序列及空載質粒電泳圖

注：M為DNA Ladder DL2000，1、2為DH5α+ pET-28b + ADA菌落擴增結果，3、4為DH5α+ pET-32a + ADA擴增結果，5、6為DH5α+ pHSIE + ADA菌落擴增結果

圖2陽性菌落PCR擴增ADA基因序列

注：A表達菌落BL21提取的pET-28b+ADA 測序結果比對部分圖；B表達菌落BL21提取的pET-32a + ADA測序結果部分圖；C表達菌落BL21提取的pHSIE + ADA測序結果部分圖

圖3陽性表達菌落測序比對結果(部分)圖

2.3陽性表達菌落測序結果 挑選BL21+ pET-28b + ADA， BL21+ pET-32a + ADA，BL21+ pHSIE + ADA陽性菌落小量培養后提取質粒，送Invitrogen公司測序。測序結果與NCBI網站基因信息比對，結果顯示，3種融合質粒中ADA編碼序列全部完整無突變(比對結果Identities 100%,Gaps 0%)，見圖3。

2.43種載體蛋白的表達及條件優化 3個表達系統分別在不同的表達時間(3、6、12、24 h) ，表達溫度(10、16、25、37 ℃)和誘導劑濃度(IPTG:0.4、0.8、1.0 mmol/L)下進行蛋白表達，通過Western-blot定性及PAGE半定量，選擇各載體最優表達條件。結果見圖4。

注：N為陰性對照

圖4 3種原核表達載體在不同條件下的蛋白表達

結果顯示，隨誘導時間和誘導溫度的增加，3種原核表達系統的蛋白表達量增多，考慮到時間成本和原核載體在較高溫度下容易形成包涵體等問題，最終采取的表達溫度為16 ℃，誘導蛋白表達24 h。誘導劑IPTG的濃度0.4、0.8、1.0 mmol/L誘導蛋白表達量相差不大，所以最終選擇IPTG的誘導濃度為0.4 mmol/L。

2.5目的蛋白活性初步鑒定結果 經檢測，菌液中ADA活性較低，菌液超聲破碎后ADA活性較高，具體數據見表1。

表1 超聲前后菌液的ADA活性(U/L)

3 討 論

參考物質從1906年美國標準局(現為國家標準技術研究院，NIST)制備和頒布了第一批冶金參考物質以來經歷了100多年的發展，在化學、生物、工程、物理等領域都發揮了巨大的作用，我國自1994年以來參照國際標準和相關導則也逐步制定了自己的標準和技術規范[11]，經過20多年的發展，我國已研制了千余種參考物質，雖然參考物質的研究取得了很大的成效，但其種類數量還遠遠不能滿足各個領域的需要，參考物質研制的任務依然艱巨。目前國內尚無ADA的參考物質，國際ADA參考物質來源于紅細胞[9]，從7 L壓縮紅細胞中經歷洗滌、裂解、層析等復雜步驟最終獲得了0.7 mg的ADA純物質，原材料不易獲得，操作過程繁雜，價格昂貴。分子克隆技術近年來已發展成熟穩定和可靠，在諸多領域都有出色的應用，如谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、乳酸脫氫酶等多項酶學參考物質的原材料均來源于原核菌株克隆蛋白的表達[12-14]，因此本實驗利用分子克隆技術構建了3種ADA的原核表達載體，并成功表達了ADA蛋白。

原核表達系統培養設備及操作簡單，生長條件要求不高，營養物質價格低廉，具有增殖速度快，轉化效率高，表達周期短和表達量高的優點，適于大規模批量蛋白生產，是目前應用最為廣泛的蛋白表達系統[15]。本實驗選用較為常用的大腸桿菌表達系統BL21(DE3)，這種表達體系是發展最早也是最成熟的外源蛋白表達系統，其具有遺傳背景清楚，表達水平穩定，易操作，有許多菌株突變體和含強啟動子的載體可供選擇，并且成本低、蛋白表達量高、容易純化等優點。在實驗中筆者構建的3種原核表達體系：BL21+pET-28b+ADA，BL21+pET-32a+ADA，BL21+pHSIE+ADA，所用到的3種質粒載體各有特色，pET-28b質粒，經過插入位點設計，只帶有1個很小的多聚組氨酸(His)標簽，使得表達的蛋白分子大小與天然的蛋白分子量相差不大，且His標簽便于后續的蛋白純化；pET-32a質粒載體，除帶有His標簽外，還帶有1個促進表達蛋白可溶的基團，可增加蛋白的可溶性，但是也會使表達蛋白的分子量增大；pHSIE質粒[16]除帶有His標簽，促表達蛋白可溶基團外，還帶有1個斷裂位點，該位點可通過蛋白純化過程中調節洗脫液的pH來使得促表達蛋白的可溶基團斷裂，可使得表達蛋白與天然蛋白保持一致性。

本實驗筆者成功將ADA序列連接入相應的質粒載體，但在進行過程中也遇到了一些小問題：如(1)引物的設計，需根據擴增目的(檢測引物，擴增引物等)按照引物設計原則和質粒載體序列設計合適的引物，加入合適的內切酶位點，同時要確認目的片段中無該酶切位點，這直接關系著酶切及連接等操作的成敗；(2)目的基因的PCR擴增，應使用具有高保真性能和擴增范圍內的高保真擴增酶，優化擴增條件，方能保證擴增所需序列的正確性；(3)感受態菌的制備，需熟練輕柔操作，并一定保證在低溫冰浴條件進行，另外用于制備感受態的菌液濃度要合適，才能保證制備的感受態菌具有較高的轉化效率；(4)對于蛋白誘導表達，誘導劑IPTG的濃度對于蛋白表達量影響不大，雖然隨時間和溫度增加，3種載體的蛋白表達量均升高，但原核蛋白在較低溫度表達時速度減慢，有利于蛋白折疊，形成有活性的蛋白，所以最終確定的IPTG濃度為0.4 mmol/L，誘導溫度均為16 ℃，誘導時間為24 h。

本實驗構建的3種原核載體表達的ADA蛋白，經活性檢測發現菌液超聲后活性較高，說明3種原核載體均非分泌表達。后期實驗將利用3個原核載體的特點，使用His-Ni柱或pH變化進行蛋白純化，而如何獲得高純度高活性的ADA蛋白是后續研究的重點問題。

4 結 論

本實驗成功構建了腺苷脫氨酶的3個原核表達體系(BL21+pET-28b+ADA，BL21+pET-32a+ADA，BL21+pHSIE+ADA)且3個體系均成功表達了有活性的ADA蛋白，表達量可觀，可滿足后續ADA標準物質研制的原材料需求，且操作簡單，經濟實用。