抗SUMO抗體在原發性膽汁性膽管炎臨床診療中的價值*

祁 雙，舒李鑫，韓崇旭

(1.揚州大學醫學院 江蘇揚州 225009；2.南京東南大學生命科學研究院,江蘇南京210096；3.揚州大學臨床醫學院/江蘇省蘇北人民醫院，江蘇揚州 225001)

原發性膽汁性膽管炎(PBC)是一種最終導致肝硬化和肝衰竭的典型慢性進展性自身免疫性疾病。病變特點是累及病人肝內膽管系統，表現為由自身免疫性T細胞引起的非化膿性膽管炎和門靜脈浸潤，并伴隨小葉間的膽管損傷[1]。經美國肝病研究協會認可，滿足以下3大標準任意2條即可確診為PBC：(1)表明膽汁淤積的生化指標——堿性磷酸酶(ALP)水平的升高；(2)抗線粒體抗體(AMA)陽性；(3)肝組織活檢顯示非化膿性破壞性膽管炎及小葉間膽管破壞。約90%～95% PBC患者可檢測出AMA的血清自身抗體，與AMAs相比，大約50%PBC患者具有血清抗核抗體(ANA)的存在[2]。ANA在PBC中的致病作用尚不清楚，但了解這些特異性自身抗體的發展過程似乎對解析PBC的致病機制至關重要。近來，表達類泛素化修飾物(SUMO)在疾病中的表達研究已初見成效，但其在PBC等自身免疫性疾病中的作用才剛剛研究。因此，基于先前的研究結果，筆者旨在探討PBC和其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗體的表達是否存在差異，抗SUMO抗體是否是潛在性的PBC特異性抗體。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究將于江蘇省各大醫院采集的412例PBC和596例其他自身免疫性疾病[包括296例系統性紅斑狼瘡(SLE)，103例干燥綜合征(SS)，117例類風濕性關節炎(RA)及80例結締組織病(CTD)]血清樣本納入研究。納入的PBC患者均符合以下幾條標準：(1)中國漢族人群；(2)肝臟的生化檢測指標堿性磷酸酶(ALP)水平的異常升高；(3)生化指標顯示膽汁淤積；(4)抗線粒體抗體/抗線粒體抗體亞型2(AMA-M2)血清學檢測為陽性或ANA血清學檢測為陽性；(5)無血吸蟲感染史；(6)各類肝炎病毒感染以及人類免疫缺陷病毒抗體陰性(乙肝病毒表面抗原陰性、血清中乙肝病毒DNA小于200拷貝數/mL、血清中丙肝病毒RNA小于500拷貝數/mL、戊肝抗原陰性、人類免疫缺陷病毒抗體陰性)；(7)患者主訴飲酒量小于100 mL/d。納入的其他自身免疫性疾病患者滿足的條件如下：(1)中國漢族人群；(2)各類肝炎病毒感染以及人類免疫缺陷病毒抗體陰性；(3)ANA血清學檢測為陽性；(4)通過病理結果等手段明確疾病的診斷，確診為其他自身免疫性疾病中的一種。本課題選用的健康對照人數500例，對照來源于東南大學校醫院健康體檢的漢族人群(健康對照的納入標準為臨床基本檢查處于正常范圍內，包括臨檢常規檢查和生化常規檢查)。其中PBC樣本包括男60例，女352例，平均年齡(55.1±11.3)歲。非PBC自身免疫性疾病樣本包括男51例，女545例，平均年齡(45.1±14.9)歲。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 電泳儀(上海天能科技有限公司)；PCR儀(美國 Bio-Rad公司)；紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；超聲波細胞破碎儀XO-650D(南京先歐儀器制造有限公司)；狹縫式雜交點樣器(樂購化工儀器BJKP-KP-31A)；冷凍離心機(德國Eppendorf 5810R)。

1.2.2試劑 DNA 6×Loading Buffer(日本TAKARA公司)；明膠(美國SIGMA公司)；脫脂奶粉(德國BIOFROXX公司)；Western Blot化學發光HRP底物ECL發光液(美國Millipore公司)；孔徑0.22μm的PVDF膜(美國Millipore公司)；HRP標記山羊抗人IgG二抗(南京金斯瑞生物科技有限公司)；96孔酶標板(美國Thermo公司)；Tween-20(美國BIOSHARP公司)。

1.3方法

1.3.1菌種和質粒 pET-28a質粒購自南京金斯瑞生物科技有限公司；GB05-Dir大腸桿菌、BL21-DE3等由本實驗室保存。

1.3.2引物的設計與合成 利用NCBI找到SUMO1、SUMO2、SUMO3 3種蛋白的編碼序列，分別設計3對引物對3種目的片段進行PCR擴增。其中SUMO1蛋白上游引物FP：AGA AGG AGA TAT ACC ATG GGC ATG TCT GAC CAG GAG GCA，下游引物RP：GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG AAC TGT TGA ATG ACC CCC；SUMO2蛋白上游引物FP：AGA AGG AGA TAT ACC ATG GGC ATG GCC GAC GAA AAG CCC，下游引物RP：GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG GTA GAC ACA TCA CGT CTG；SUMO3蛋白上游引物FP：TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG TCC GAG GAG AAG CCC AAA GAG，下游引物RP：GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG GAA ACT GTG CCC TGC CAA GCT。

1.3.3人SUMO1、SUMO2、SUMO3基因原核表達載體的構建 利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增3種目的蛋白的DNA片段。PCR反應體系為：95 ℃，預變性3 min，95 ℃變性30 s、60 ℃復性30 s、72 ℃延伸35 s、30個循環后72 ℃ 5min終止反應。選擇已構建好的含His標簽序列的pET-28a質粒，根據多克隆位點以NcoI和XhoI作為酶切位點，對該質粒進行雙酶切。將擴增的PCR產物和酶切后的質粒混合，導入GB05-Dir大腸桿菌培養。通過卡納抗性篩選陽性單克隆，經PCR進行菌落擴增。采用成品試劑盒對過夜培養的菌種提取含目的DNA片段的重組質粒，采用紫外分光光度計測試其濃度。將提取的重組質粒送南京金斯瑞公司測序，以檢測重組質粒是否構建成功。

1.3.4人SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白在大腸桿菌中的誘導表達 將測序正確的人SUMO1、SUMO2、SUMO3重組質粒轉化至BL21-DE3，選取陽性單克隆于液體培養基37 ℃振蕩培養至OD值約為0.6。在誘導劑IPTG(1M/L)的條件下分別于37 ℃搖床培養4 h和25 ℃搖床過夜。收獲不同條件下的菌液，SDS-PAGE電泳檢測。最終確定菌種的最適誘導表達條件為37 ℃搖床培養4 h。

1.3.5人SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白表達產物分離與純化 將置于-80 ℃冰箱保存的菌體取出，用20 mL 5mM咪唑(作為裂解緩沖液)(Lysis buffer)重懸。期間按1∶500添加PMSF以防止蛋白降解。再按1∶100添加溶菌酶(1 M/L)，之后每隔5 min渦旋振蕩1次，冰上孵育30 min。超聲破菌，功率36%，每次工作2 s，間歇3 s，待上清液澄清可透光提示破菌完成。采用親和層析柱和超濾管進行蛋白的純化。為防止蛋白降解，在超濾之后需將目的蛋白分裝到若干個EP管中，做冷干，制成蛋白干粉并置于-80 ℃超低溫冰箱長久保存。

1.3.6篩選PBC中抗SUMO抗體陽性樣品 采用斑點印跡法初步大量篩查PBC患者血清樣本中抗SUMO抗體陽性標本，實驗保證每孔的蛋白上樣量500 ng左右。通過Western blot驗證斑點印跡法篩選出的抗SUMO抗體陽性樣品，獲取陽性參考血清。SDS-PAGE分離凝膠濃度為15%，樣品量約為2.5 μg；SDS電泳條件：先低壓再高壓(從80 V，40 min至140 V，1 h);轉膜條件：恒定電流，200 mA，1 h。

1.3.7建立抗SUMO抗體ELISA診斷體系 采用碳酸鹽緩沖液作為SUMO蛋白(抗原)的包被液，分別設置100、200、300、500 ng 4個梯度進行實驗以選取最適抗原包被量。加樣后，用保鮮膜覆蓋整塊微孔板，4 ℃冰箱過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗3遍，拍干。使用1%的明膠作為封閉液(1×PBS作為稀釋液)封閉酶標反應孔，每孔加300 μL封閉液，室溫下封閉2 h。2 h后棄去封閉液，用PBST洗3遍。加入稀釋好的待檢樣品(PBC患者血清，稀釋比為1∶200，稀釋液為1%的BSA 磷酸鹽緩沖液)，每孔加樣100 μL，室溫下孵育2 h。實驗設置1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000 6個稀釋梯度以確認最適一抗滴度。據說明書推薦的HRP標記的山羊抗人IgG二抗最適稀釋比(1∶40 000，稀釋液為1%的BSA 磷酸鹽緩沖液)進行實驗。最終A液和B液1∶1等比例(各50 uL)混合顯色，2M H2SO4終止反應。

1.3.8Western blot和斑點印跡法驗證ELISA篩選出的抗SUMO抗體陽性樣品 將ELISA篩選出的抗SUMO抗體陽性標本通過Western blot和斑點印跡法驗證，證明cutoff值的正確性和ELISA體系的有效性。實驗步驟同上述1.3.6。

2 結 果

2.1SUMO 3種蛋白亞型的純化結果 通過NCBI找到SUMO1、SUMO2、SUMO3 3種蛋白亞型的編碼序列，構建3種重組質粒。待質粒構建成功后，將其分別導入大腸桿菌進行蛋白的誘導與表達。通過條件的不斷改進，獲得條帶單一、純度較高的目的蛋白。3種蛋白亞型純化結果如圖1所示。

注：圖中M代表蛋白Marker，目的蛋白在(17～18)×103左右

圖1 3種SUMO蛋白亞型的純化結果

2.2抗SUMO抗體ELISA診斷體系的構建

2.2.1獲取抗SUMO抗體陽性樣本 412例PBC患者樣本進行抗SUMO抗體陽性的初步篩查。部分結果如圖2示。為證明斑點印跡檢驗系統的有效性，筆者從初篩出的抗SUMO陽性樣品中隨機挑選出部分，采用Western blot方法再次驗證。結果顯示2種檢驗方法的結果基本上是一致的。

2.2.2確定最適ELISA抗原包被量和一抗滴度 經實驗條件的不斷改進，以陽參和陰參樣品的OD值能拉開較大差距的抗原包被量和一抗滴度為最佳濃度，確定本實驗選取的最佳抗原包被量為500 ng，1∶200為最佳血清稀釋比。

2.3ELISA診斷效率的評價 在構建抗SUMO抗體檢測的最佳ELISA診斷體系后需要對該體系的診斷效率進行評價。用已驗證的抗SUMO抗體陽性的PBC標本作為陽性樣本，健康人的體檢樣本作為陰性樣本進行ELISA診斷性能的評價，分別統計實驗的陰陽性例數，計算靈敏度和特異度[特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%；靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%]。如表1所示。

注：圖中BP(BCOADC-PDC耦聯的抗原)為PBC患者的檢驗標志物，作為陽參；cTnT、cTnI、IL21為陰參；圖左邊編號為PBC患者的樣本編號；圖A和圖B是PBC樣品的斑點印跡圖，圖C是PBC樣品的Western blot圖

圖2 PBC樣本的部分斑點印跡圖和Western blot圖表1 抗SUMO抗體 ELISA診斷效率評價(%)

注：cut off值=3×mean control OD，OD值大于1.1×cutoff值的樣品定義為陽性，OD值介于0.9×cut off值和1.1×cut off值之間的樣品定義為灰區，灰區樣品二次驗證，若仍處于灰區，則定義為陽性

注：圖中AID代表自身免疫性疾病，A顯示抗SUMO抗體在PBC和健康對照中的表達；B顯示非PBC自身免疫性疾病和健康對照中抗SUMO抗體的表達分布

圖3抗SUMO抗體在PBC，其他自身免疫性疾病及健康對照中的表達

2.4ELISA檢驗PBC和其他自身免疫性疾病血清樣本 用構建的ELISA診斷體系對412例PBC血清樣本和596例其他自身免疫性疾病(包括CTD 80例，SLE 296例，RA 117例，SS 103例)血清樣本進行ELISA檢驗。結果如圖3所示。

2.5Western blot和斑點印跡法驗證其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗體陽性標本 隨機挑選通過ELISA篩選出的其他自身免疫性疾病中的抗SUMO抗體陽性標本進行Western blot和斑點印跡法的驗證，以證明ELISA檢測系統的有效性。見圖4。

注:圖中BP(BCOADC-PDC耦聯的抗原)為PBC患者的檢驗標志物；cTnT、cTnI、IL21為陰參。樣品SLE152經查病歷證實患有心肌梗死性疾病

圖4其他自身免疫性疾病樣品的部分Western blot和斑點印跡圖

2.6PBC和其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗體陽性率比較 對412例PBC樣本和596例其他自身免疫性疾病樣本進行ELISA檢測，統計抗SUMO抗體兩組樣本中的陽性率。采用統計學方法χ2檢驗計算二者的陽性率差異。實驗結果如表2所示。結果顯示3種抗SUMO抗體在PBC和其他自身免疫性疾病人群中的陽性率存在顯著差異，差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 抗SUMO抗體在PBC及其他自身免疫性疾病中的陽性率比較[n(%)]

注：其他自免疾病包括CTD 80例，SLE 296例，RA 117例及SS 103例

2.7其他自身免疫性疾病中的抗SUMO抗體陽性率表達 實驗對596例其他自身免疫性疾病(CTD 80例，SLE 296例，RA 117例及SS 103例)進行ELISA檢測，統計抗SUMO抗體的陽性率(圖5)。采用χ2檢驗分析比較4組間的陽性率差異，結果如表3所示。結果顯示，抗SUMO抗體在其他自身免疫性疾病中的陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，因此認為抗SUMO抗體對于鑒定其他自身免疫性疾病無意義。

表3 抗SUMO抗體在其他自身免疫性疾病中的陽性率比較[n(%)]

圖5 其他自身免疫性疾病中抗SUMO抗體的陽性率表達分布

3 討 論

PBC的治療效果不佳，早期診斷和治療是控制PBC疾病發展的最有效手段。但不同的PBC患者，他們的病癥表現不盡相同，同時也伴隨不同的并發癥，這對患者的對癥治療產生很大的難度。

目前，針對PBC的特異性抗體包括AMA-M2、抗核抗體Sp100及抗Gp210。AMA因其特異度高，是PBC的關鍵性診斷標志。PBC的血清學特征是高滴度的AMA，其主要靶點為BCOADC-E2、PDC-E2和OGDC-E2。但是，AMA也可在其他疾病如硬皮病中檢測到。因此，尋找新的血清標志物，如抗SUMO抗體，對于區分PBC與其他自身免疫性疾病至關重要[3-4]。

SUMO蛋白分布廣泛。人類基因組主要編碼4種SUMO蛋白亞型SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4[5]。其中，SUMO1～3起主要作用并在各種組織中均有表達，而SUMO4主要在腎、脾和淋巴結中表達[6]。在各亞型中，SUMO1和SUMO2具有50%的序列同源性，SUMO2和SUMO3高度相似，僅有3個氨基酸差異，同源性高達95%，所以經常共寫為SUMO2/3[7-8]。在針對3種SUMO蛋白亞型的實驗組中，筆者發現抗SUMO2抗體和抗SUMO3抗體在PBC和其他自身免疫性疾病兩組間的陽性率差異P值接近(表2)，表明SUMO2和SUMO3二者同源性高。鑒于成熟SUMO2和SUMO3蛋白之間的高度同源性，筆者推測識別抗SUMO2抗體的疾病也可能同時識別抗SUMO3抗體，這有待后續實驗進一步考證。

PBC起病隱匿，表現為慢性進行性膽汁淤積性肝病，最終導致肝硬化和肝功能衰竭。其作為典型的自身免疫性疾病的一種，目前診斷依賴于臨床表現，特異性自身抗體的檢測和病理組織學檢查[9-11]。AMA-M2是PBC的特異性抗體，其特異度高達95%，但AMA對PBC的診斷仍有局限性，約有10%的PBC患者AMA陰性，這給診斷帶來一定困難，有時需依賴有創檢查肝活檢，存在一定風險且患者依從性差[12-13]。本研究發現抗SUMO抗體在PBC中的診斷特異度高達99%，其靈敏度保持在86%左右(表1)。表明抗SUMO抗體可以成為輔助診斷PBC的一個新的血清標志物。

PBC常伴有其他自身免疫性疾病，包括SS、SLE、CTD、RA等。本研究發現上述其他自身免疫性疾病中3種抗SUMO抗體均有一定的檢出率，尤以SS和RA較高，提示這類患者有合并潛在的亞臨床PBC的可能性，需要密切隨訪，以便于早期發現，早期治療，改善疾病預后[14]。筆者還發現抗SUMO抗體在PBC中的陽性率明顯高于其他自身免疫性疾病組和健康對照組，陽性表達率差異有統計學意義(表2)，說明抗SUMO抗體和PBC存在很好的相關性，對于輔助診斷PBC具有良好的效益。鑒于非PBC的自身免疫性疾病中的抗SUMO抗體的低陽性率(圖5)，筆者對296例SLE，103例SS，80例CTD及117例RA進行研究，發現抗SUMO抗體在其他自身免疫性疾病人群中的陽性率無明顯差異(表3)，說明抗SUMO抗體對于鑒定其他非PBC的自身免疫性疾病無特異度，抗SUMO抗體有望成為診斷PBC的潛在性特異性抗體。

像其他PBC自身抗體一樣，抗SUMO抗體在PBC或其他自身免疫性疾病中的發病機制仍然未知。有趣的是，一項研究表明大量的SUMO結合物可以在線粒體中找到，盡管構成AMA自身抗原的線粒體復合物的SUMO化尚未報道。線粒體抗原的異常表達歸因于在應激條件下失調的自噬，最終導致自身免疫介導的細胞毒性反應，特別是小膽管的損傷。因此后期研究抗SUMO抗體產生是否是細胞因子依賴性將是有意義的。另外據文獻報道，抗Sp100抗體表達可能通過介導膽管細胞增生參與PBC發病[15]。膽管細胞增生在PBC組織病理中較常見，膽管性界面炎含有增生膽管和肉芽腫的碎屑樣壞死，提示膽管細胞增生在PBC的進展中起到一定作用。而SUMO蛋白可以通過修飾Sp100蛋白發揮SUMO化修飾作用，表明SUMO對于PBC的致病機制也有可能一部分是通過介導膽管細胞增生實現的。

PBC是復雜性自身免疫性疾病研究的極佳模型，與其他自身免疫性疾病相比，PBC具有明顯的組織專一性和很強的遺傳易感性。目前，熊去氧膽酸是對早期PBC患者(尤其是黃疸沒有出現的患者)進行有效控制的藥物，但無治愈作用。而挽救晚期PBC患者的唯一手段是實施肝臟移植手術治療[16-17]。鑒于SUMO在PBC中可以作為一種新的抗原成分，而SUMO化修飾和去SUMO化修飾過程的失控可能使細胞不能維持動態平衡，進而暗示著疾病的發展。所以，對SUMO化的研究可能蘊含著治療PBC疾病的潛在靶點。

診斷試驗的持續改進導致對輕度或明顯無癥狀疾病的個體的檢測陷入熱潮。另外，特別是基于患者基因型和表型的分層將在未來變得重要。本研究結果表明，抗SUMO抗體是高特異度的PBC新標記物，有必要將抗SUMO抗體納入PBC的血清學評估。這將有助于消除PBC診斷不確定性，提高診斷效率，建立PBC早期診斷方法和診斷指標，并評估PBC預后藥物的個體化以提供標準化的臨床診斷和治療方案。

4 結 論

本研究通過建立抗SUMO抗體的ELISA診斷體系，分別檢測抗SUMO抗體在PBC、SLE、SS、CTD、RA 5種典型性自身免疫性疾病血清樣本中的陽性率表達，最終證實抗SUMO抗體和PBC存在很好相關性，有望成為診斷PBC的特異度抗體。其創新之處在于分別構建了SUMO1、SUMO2、SUMO3 3種蛋白亞型的表達質粒并分別研究3種抗SUMO抗體在5種自身免疫性疾病中的表達，其有利于后期提高疾病的診斷效率，并具有廣泛的臨床應用和推廣前景。但本實驗并未證明抗SUMO抗體與PBC間的直接因果性，因此未來研究方向將進一步揭示抗SUMO抗體的狀態是否與PBC的臨床進程相關并分析PBC患者接受熊去氧膽酸前后抗SUMO抗體的變化等。