結(jié)核感染患者外周血中性粒細(xì)胞自噬水平的研究

杜金艷，王 燕，張 燕，陳 敏，鄧少麗，陳 鳴,唱 凱

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400042)

結(jié)核病作為當(dāng)今世界重要的傳染病之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，全球約1/3的人感染過結(jié)核分枝桿菌(MTB)[1]。然而在眾多的感染人群中，絕大多數(shù)并不表現(xiàn)出任何臨床癥狀，僅有約10%的感染者會在一生中的某個時間段發(fā)展成為結(jié)核病[2]。

自噬，是將細(xì)胞內(nèi)功能不全的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解的一種方式，同時也在免疫和炎癥中起主要作用。當(dāng)MTB入侵免疫細(xì)胞后會誘導(dǎo)抗炎和(或)促炎細(xì)胞因子的釋放，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞自噬對MTB的清除。Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MAPLC3)是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因，并且LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，長期穩(wěn)定存在直至與溶酶體相結(jié)合，常作為自噬體的標(biāo)記分子。研究發(fā)現(xiàn)，嗜中性粒細(xì)胞通過產(chǎn)生更高水平的活性氧(ROS)，增加其吞噬體的pH值并引起結(jié)核分枝桿菌自噬，進(jìn)而介導(dǎo)記憶性CD8+T細(xì)胞的殺菌活性，表明嗜中性粒細(xì)胞在結(jié)核感染過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。目前關(guān)于中性粒細(xì)胞自噬水平在結(jié)核感染中的作用鮮有研究報道，且自噬相關(guān)基因Beclin1在中性粒細(xì)胞中所誘導(dǎo)的自噬是否參與人體對結(jié)核分支桿菌的調(diào)控仍不清楚。據(jù)此，本研究從自噬這一細(xì)胞的自發(fā)性防御機(jī)制著手，通過分析結(jié)核感染患者外周血中中性粒細(xì)胞LC3及Beclin1 mRNA的表達(dá)情況，深入探究中性粒細(xì)胞在結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制過程中的作用，為MTB的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 依據(jù)肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)，選擇2016年12月至2017年6月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心和陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院就診的初治結(jié)核病患者，共24例，健康對照組選擇在該區(qū)域中無血源關(guān)系的同期入院患者，無肺結(jié)核癥狀或體征，實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢測均未提示為肺結(jié)核者，共16例。排除疾病情況：免疫抑制劑使用者、合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 分別抽取活動性結(jié)核組、健康對照組空腹外周血3～5 mL于EDTA抗凝管，3～6 h內(nèi)檢測自噬水平后分離目的細(xì)胞提取總RNA。

1.2.2引物的查找與選擇 通過查找Beclin1基因數(shù)據(jù)信息和文獻(xiàn)，利用Primer5.0軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，如表1，采用GAPDH基因作為內(nèi)參基因。

表1 PCR 引物及擴(kuò)增片段

1.2.3采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行自噬水平檢測 Flow CellectTM Autophagy LC3 Antibody-based Assay Kit，自噬檢測試劑盒購Millipore公司，儀器為BECMAN，按試劑盒和儀器要求進(jìn)行操作。

1.2.4外周血中性粒細(xì)胞提取 細(xì)胞分離試劑購自Thermo Fisher Scientific公司，具體操作步驟如下：(1)取紫頭管全血1∶1加入1640培養(yǎng)基稀釋，混勻備用；(2)依次加入75%Percoll、60%Percoll 各4 mL于15 mL離心管，加入時不能有任何上層液體沖入下層的情況；(3)將混勻的稀釋血液加入最上層；(4)450 g離心20～25 min；(5)液體分3層，最上一層與中間層之間細(xì)胞多為淋巴細(xì)胞。最下層與中層細(xì)胞為中心粒[5]；(6)用滴管吸出目的細(xì)胞，加入新15 mL離心管，加1640培養(yǎng)基，補(bǔ)充至14 mL；(7)450 g離心10 min，棄上清；(8)用1 000 μL PBS重懸；(9)轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，1 000 r/min，離心5 min(4 ℃低溫高速離心機(jī))，棄上清(瑞氏染色后顯微鏡計數(shù)，觀察有無中性粒細(xì)胞，拍照保存)；(10)加入1 000 μL PBS，1 000 r/min，離心5 min(4 ℃低溫高速離心機(jī))，棄上清，加入400 μL，按1∶3加入1 mL Trizol溶液，反復(fù)震蕩，做好標(biāo)記，存放于-80 ℃超低溫冰箱，待提取RNA。

1.2.5RNA的提取及質(zhì)量檢測 取出保存樣本室溫解凍，提取總RNA。在ThermoND-1000上進(jìn)行OD260/OD280檢測，選擇RNA在1.8～2.0范圍內(nèi)的樣品用于熒光定量PCR反應(yīng)，剩余的RNA溶液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及熒光定量PCR 試劑盒購自Roche公司，將模板RNA及相應(yīng)試劑解凍，逆轉(zhuǎn)錄PCR儀為ABI，程序?yàn)椋?1)逆轉(zhuǎn)錄延伸：37 ℃，60 min；(2)滅活逆轉(zhuǎn)錄酶：85 ℃，5 min。取出產(chǎn)物，迅速置冰浴5 min；2～8 ℃保存1～2 h或在BIO-RAD(CFX-96)上立即進(jìn)行熒光定量，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；95 ℃(20 s)→60 ℃(20 s)→72 ℃(20 s)→40個循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1一般臨床資料 本次臨床標(biāo)本收集健康對照組樣本16例，其中成年男性6例，平均年齡為(42.96±3.52)歲；成年女性10例，平均年齡為(49.40±5.33)歲；活動性結(jié)核組樣本24例，其中成年男性19例，平均年齡為(42.96±3.52)歲；成年女性5例，平均年齡為(49.40±5.33)歲。活動性結(jié)核組與健康對照組相比，年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.165 5，P>0.05)；活動性結(jié)核組男性(79.2%)比例明顯高于健康對照組(37.5%)。

2.2自噬水平比較 采用流式細(xì)胞術(shù)對活動性結(jié)核組和健康對照組外周血中性粒細(xì)胞和單個核細(xì)胞的自噬水平進(jìn)行檢測，分析在單個核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中LC3的表達(dá)情況。活動性結(jié)核組單個核細(xì)胞自噬水平與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.784 2，P>0.05)；中性粒細(xì)胞自噬水平明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013 8，P<0.05)，見圖1～6。

圖1 健康對照組單個核細(xì)胞自噬水平

圖2 活動性結(jié)核組單個核細(xì)胞自噬水平

圖3 兩組單個核細(xì)胞自噬水平比較

圖4 健康對照組中性粒細(xì)胞自噬水平

2.4中性粒細(xì)胞Beclin1 mRNA的表達(dá)水平 采用實(shí)時熒光定量PCR對活動性結(jié)核組和健康對照組外周血中性粒細(xì)胞Beclin1 mRNA進(jìn)行檢測。以活動性結(jié)核組結(jié)果為1，發(fā)現(xiàn)活動性結(jié)核組中性粒細(xì)胞Beclin1 mRNA相對內(nèi)參基因表達(dá)低于健康對照組(如圖7)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖5 活動性結(jié)核組中性粒細(xì)胞自噬水平

圖6 兩組中性粒細(xì)胞自噬水平比較

圖7 Beclin1 mRNA相對表達(dá)情況

3 討 論

自噬，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及物質(zhì)的循環(huán)利用上具有重要作用。雙層膜結(jié)構(gòu)包被細(xì)胞質(zhì)形成自噬小體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，將內(nèi)容物進(jìn)行降解，對細(xì)胞內(nèi)外的細(xì)微變化能迅速做出反應(yīng)，有利于細(xì)胞快速適應(yīng)環(huán)境變化[6-7]，按照方式不同可分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。自噬是機(jī)體免疫非常重要的環(huán)節(jié)，它既可以直接殺滅MTB，又可以為抗原提呈啟動細(xì)胞免疫作準(zhǔn)備[8]。中性粒細(xì)胞，作為機(jī)體主要的免疫細(xì)胞之一，MTB感染后，迅速從外周血遷移到感染灶，活化并吞噬MTB，并通過NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS，對吞噬的MTB起到快速有效的殺滅作用，但同時也會促進(jìn)中性粒細(xì)胞自身的壞死，造成MTB的免疫逃逸[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，活動性結(jié)核組男性比例明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在男性中，吸煙、飲酒以及重體力勞動比例高于女性，以上危險因素可能降低機(jī)體免疫功能，顯著增加男性結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險[10-11]。活動性結(jié)核組中性粒細(xì)胞自噬水平(LC3)及Beclin1基因表達(dá)明顯低于健康對照組。LC3是目前對自噬具有高度特異性的標(biāo)志物，參與自噬體隔離膜的形成。MTB感染免疫細(xì)胞后，LC3-1型(胞質(zhì)型)轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-2型(胞膜型)，通過對其定位可反映細(xì)胞的自噬水平。Beclin1基因是第一個被鑒定的自噬基因，是酵母自噬基因ATG6的同源物，是參與自噬調(diào)控的重要基因[12]。結(jié)核病的發(fā)生是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫產(chǎn)生的抗體對其作用局限，故推測活動性結(jié)核組自噬水平的降低及Beclin1基因表達(dá)的下調(diào)與MTB感染及破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)有關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白可以激活mTOR蛋白，從而抑制細(xì)胞的自噬[13]。

中性粒細(xì)胞具有吞噬并殺滅細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分支桿菌的作用，而且這種殺菌機(jī)制與MTB感染同LC3蛋白減少有關(guān)，從而推斷中性粒細(xì)胞也直接參與抗結(jié)核分枝桿菌免疫。目前，關(guān)于Beclin1基因?qū)χ行粤＜?xì)胞所誘導(dǎo)的自噬與MTB感染調(diào)控的研究較少，機(jī)制并不清楚，隨著對自噬進(jìn)一步的研究，可深入了解中性粒細(xì)胞自噬情況在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的具體過程，為結(jié)核病的治療提供新的靶向治療方案。

4 結(jié) 論

目前關(guān)于結(jié)核感染患者外周血中性粒細(xì)胞自噬水平在結(jié)核感染中報道較少，本研究從細(xì)胞自發(fā)性防御機(jī)制著手，分析中性粒細(xì)胞中自噬標(biāo)志性蛋白LC3水平及相關(guān)基因Becline 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染患者外周血中性粒細(xì)胞自噬水平LC3降低，且Becline基因表達(dá)的下調(diào)，可能與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。