重慶地區金黃色葡萄球菌臨床株的分子型別與耐藥性檢測

林 君，曹 利

(1.重慶市第七人民醫院檢驗科，重慶 400054；2.陸軍軍醫大學西南醫院，重慶 400038)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，簡稱金葡菌)是一種重要的人獸共患病原菌，常引起人皮膚軟組織感染、肺炎、心內膜炎、敗血癥，動物乳房炎等疾病，死亡率高[1]。金葡菌的播散主要以特定的克隆群傳播為主。檢測和明確特定區域的金葡菌主要流行克隆及其菌株的耐藥水平，對切斷其傳播途徑，終止耐藥金葡菌感染具有重要的現實意義。

按菌株耐藥性的差異，金葡菌通常分為耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)，這兩者的主要區別在于前者染色體中攜帶一葡萄球菌盒式染色體(SCCmec)，其中的耐藥基因mecA可編碼對甲氧西林等β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的決定簇PBP2a，介導MRSA的耐藥性[1-2]。多種分子分型技術，如多位點序列分析(MLST)、葡萄球菌A蛋白(spa)基因分型以及附屬基因調節子(agr)分型等已被廣泛應用于MRSA的進化和流行病學研究[3]。研究證實，ST5、ST239和ST8是世界范圍內流行的主要MRSA克隆群[4]。在我國，MRSA分離率雖因地區不同而有較大差異，總體上約占金葡菌感染的60%左右，ST239、ST5和ST59也是我國MRSA優勢流行克隆[4]；MSSA在我國占金葡菌感染的40%左右，但目前對MSSA的研究報道較少。相對于MRSA而言，通常認為MSSA不存在優勢克隆，而表現出更高的遺傳多樣性及更高的毒力因子表達[5]，并且與菌血癥、心內膜炎以及敗血癥關聯更密切[6]。在MRSA和MSSA的菌株進化分析中發現，MSSA獲得SCCmec遺傳元件是MRSA的重要來源，MSSA可作為MRSA毒力因子的資源庫。葡萄球菌殺白細胞毒素(pvl)是金葡菌重要的毒力因子，在金葡菌感染中性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞等過程中發揮重要作用[7]。流行病學研究證實，ST8、ST59、ST121、ST398是主要的攜帶pvl基因的克隆[8]。

分子分型是金葡菌分子型別確定的重要方法，筆者采用多種金葡菌分子分型方法，結合pvl毒力基因檢測和耐藥譜分析，對2013年6月至2014年12月從重慶西南醫院分離的110株金葡菌進行了分子型別檢測研究，一方面從一定程度上揭示了重慶地區金葡菌的流行特征和耐藥狀態，另一方面也為我國其他地區金葡菌感染和流行的檢測分析提供了參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 110株金葡菌分離自重慶西南醫院，主要源自2013年6月至2014年12月期間110位住院患者的痰液、膿液、血液、穿刺液、分泌物等標本。

1.1.2儀器與試劑 PCR儀、垂直電泳儀、凝膠成像儀為Bio-Rad設備，Bio-Fosum微生物鑒定藥敏分析儀為上海復星佰珞公司產品;TSB、BHI培養基為OXOID產品。

1.1.3引物 金葡菌分子分型及pvl毒力基因檢測引物均參照文獻設計[9-14]，由華大基因合成。具體引物序列見表1。

表1 分子分型及毒力基因檢測所用引物序列及擴增大小

續表1 分子分型及毒力基因檢測所用引物序列及擴增大小

1.2方法

1.2.1細菌培養、基因組提取及菌株鑒定 細菌的分離培養按《全國臨床檢驗操作規程》進行，基因組提取參照文獻[9]所述方法進行。金葡菌及MRSA、MSSA的鑒定通過PCR方法分別檢測金葡菌分離菌株的mecA與femB基因[9]。若femB基因為陽性，mecA基因為陰性判斷為MSSA菌；mecA與femB基因皆陽性者，判為MRSA菌。

1.2.2spa分型 用特異性引物通過PCR擴增出金葡菌spa基因的X區[10]，對PCR產物進行測序分析，將獲得的序列提交spa基因分型數據庫(http://www.ridom.de/spaserver)，參照已公布的重復序列，根據重復序列出現的次數和排列方式確定型別[26]。

1.2.3MLST分型 分別擴增金葡菌7個管家基因(arcc、aroe、glp、gmk、pta、tpi、yqil)序列，產物進行DNA測序，所獲序列提交MLST數據庫(http://saureus.mlst.net/)進行分析得出其MLST型別，即序列型(ST)[11]。

1.2.4MRSA菌株的SCCmec分型 根據文獻[12]所述方法，通過PCR方法進行金葡菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型的SCCmec分型。

1.2.5MSSA菌株的agr分型 參照文獻[13]所述方法，通過多重PCR擴增MSSA菌株基因組，PCR產物進行電泳，441、575、323、和659 bp大小的條帶分別代表agr Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、和Ⅳ型。

1.2.6pvl毒力基因及耐藥基因檢測 通過PCR方法，用特異性引物擴增所有金葡菌的pvl基因[14]，判斷菌株的毒力基因攜帶情況。

1.2.7藥敏試驗 用Bio-Fosum微生物鑒定藥敏分析儀(上海復星佰珞公司) 對菌株的耐藥情況進行測定，按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI) 2015年出版的瓊脂稀釋法藥敏試驗解釋標準判斷菌株對抗菌藥物的耐藥狀態[15]，以耐藥(R)、敏感(S)表示。

1.2.8多重耐藥菌的判定 按照文獻[16]，某株金葡菌如果對至少3類抗菌藥物耐藥(每類抗菌藥物中至少有一種代表藥物耐藥)，則定義該菌株為多重耐藥(MDR)菌株。

2 結 果

2.1MRSA與MSSA鑒定 110株臨床金葡菌經PCR擴增mecA和femB基因檢出MRSA菌株59株，占53.6%，MSSA菌株51株，占46.4%。

2.2分子分型

2.2.1spa分型 對PCR擴增產物的測序結果進行分析，110株金葡菌株可分為38種spa基因型(表2)。其中59株MRSA分為11種spa基因型，優勢型別為t037(28.8%，17/59),t437(27.1%，16/59)，t138(16.9%,10/59)和t030(11.9%,7/59)；51株MSSA分為27種spa基因型，主要型別有t7146(13.7%,7/51)，t3297(7.8%,4/51)和t189(5.9%,3/51)。另外有9株MSSA菌未能分型，可能為新的spa型別。

2.2.2MLST分型 110株金葡菌可分為26種ST型(表2)。在59株MRSA中，優勢型別為ST239(57.6%,34/59)和ST59(28.8%,17/59)，另外發現1株不能分型，可能為新的ST型；51株MSSA分為18種ST型，主要型別有ST7(19.6%，10/51)，ST15(11.8%,6/51)，ST25(7.8%,4/51)，ST1188(7.8%,4/51)，ST398(7.8%,4/51)，ST5(5.9%,3/51)、ST464 (5.9%,3/51)和ST943(5.9%,3/51)。

2.2.3MRSA菌株的SCCmec分型 經多重PCR擴增，59株MRSA菌株檢出SCCmec Ⅲ型34株(57.6%)，SCCmec Ⅰ型12株(20.3%)，SCCmec Ⅳ型7株(11.9%)，SCCmec Ⅴ型6株(10.2%)，結果見表2。

2.2.4MSSA菌株的agr分型 將51株MSSA菌株進行agr分型，檢測出agr Ⅰ型35株，占68.6%，agr Ⅱ型9株(17.7%)，agr Ⅲ型4株(7.8%)，agr Ⅳ型3株(5.9%)。見表2。

2.2.5pvl基因檢測 59株MRSA菌株中，pvl毒力基因檢出率為23.7%(14/59)，14株pvl陽性菌株中有8株為ST239型，另6株為ST59型;51株MSSA菌株中有4株為pvl陽性(7.8%)，分別為ST1、ST88、ST398和ST938型(表2)。

表2 110株金葡菌的分子特征(括號內為菌株數)

表3 金葡菌臨床分離株抗菌藥物藥敏試驗結果

2.3藥敏試驗分析 110株金葡菌對13種抗菌藥物的藥敏試驗結果見表3。MRSA對糖肽類抗菌藥物[萬古霉素(VAN)、替考拉寧(TEC)]和唑烷酮類抗菌藥物[利奈唑胺(LZD)]全部敏感，但是對其余被檢抗菌藥物的耐藥率則較高。相對于MRSA菌株而言，MSSA菌株對大多數抗菌藥物敏感，但對青霉素(PEN)、紅霉素(ERY)、克林霉素(CLI)、環丙沙星(CIP)、復方新諾明(SXT)、慶大霉素(GEN)和四環素(TET)等均表現出一定的耐藥性。

2.4MDR菌株的耐藥譜及分子特點 所有的MRSA菌株均為MDR菌株，而51株MSSA菌株中有24株為MDR菌株。34株ST239 MRSA菌株有共同的耐藥譜PEN/CIP/GEN/RIF/TET/LEV。24株MSSA多重耐藥菌株中，有12株對3類抗菌藥物耐藥，其耐藥譜見表4；有50%的MSSA菌株對3種以上的抗菌藥物耐藥，其中1株對6類抗菌藥物耐藥(PEN/ERY/CLI/SXT/CIP/TET)，表明敏感菌MSSA中的多重耐藥性也不容忽視。

表4 MSSA多重耐藥菌株株耐藥譜及其分子特點

3 討 論

自20世紀80年代以來，MRSA因具有較強的定植能力和外界環境適應能力，在全球范圍內迅速傳播，成為醫院和社區獲得性感染的重要病原菌。在我國，臨床金葡菌中的MRSA檢出率從1980年的20%迅速升高到2008年的約60%[17]，引起了我國醫務工作者的高度關注。流行病學研究表明，ST239-MRSA-Ⅲ和ST5-MRSA-Ⅱ是我國MRSA優勢流行型別[4]。本研究中，來自重慶地區的MRSA檢出率為53.6%(59/110)，接近全國平均水平，該地區的MRSA優勢流行型別為ST239-MRSA-Ⅲ (57.6%,34/59)和ST59-MRSA-Ⅰ/Ⅳ/Ⅴ(28.8%,17/59)，這一結果與以往報道的對重慶MRSA的分析結果相一致[4,18]。ST239是亞洲國家的主要流行克隆[19]，有研究證實，ST239-MRSA-Ⅲ-t037，是我國北京地區2000年之前的主要克隆，之后逐漸被ST239-MRSA-Ⅲ-t030取代[20]，本研究中ST239-MRSA-Ⅲ-t037仍然是最優勢克隆(50.0%,17/34)，而ST239-MRSA-Ⅲ-t030占20.6%(7/34)，表明ST239-MRSA-Ⅲ-t037型菌株在重慶地區有更強的適應能力和傳播能力。藥敏試驗結果表明，MRSA菌株全部為多重耐藥菌。

和MRSA相比，MSSA菌株通常擁有更高的遺傳多樣性[21]，在我國的研究報道中，主要的MSSA型別因地區不同而差異較大[20,22]。本研究中鑒定的51株MSSA菌可分為18種ST型別和27種spa型，相對于MRSA菌株(8種ST型別，11種spa型)而言，MSSA具有更多的克隆多態性。ST7、ST15、ST25、ST88、ST188、ST398、ST5、ST464和ST943是該地區主要的MLST型別。ST121是在全球廣泛分布的社區獲得性克隆群，因其高毒力而引起研究者關注[23]。我國對于ST121金葡菌的報道較少，在本研究中，有2株MSSA菌株檢測為ST121型(3.9%，2/51)，此2株菌雖未攜帶pvl毒力基因，但其高毒力特征值得深入研究。

在歐美地區，臨床分離的MSSA對除青霉素之外的大多數常用抗菌藥物敏感[21,24]，因此MSSA的耐藥情況在國外并未引起關注。在我國的報道中，已發現MSSA除對PEN耐藥外，還對ERY、CLI等存在不同程度的耐藥[25]。在本研究的51株MSSA菌株中檢出了高比例的多重耐藥菌株(47.1%，24/51)，這些MDR菌有不同的耐藥譜，但多數對PEN、ERY和CLI耐藥(75.0%，18/24)。在這些MDR型MSSA中，有3株對五類抗菌藥物耐藥，另外有1株菌株對6類抗菌藥物耐藥，提示MSSA的耐藥性在重慶地區不容樂觀，值得臨床高度關注。

4 結 論

本研究在一定程度上揭示了重慶地區MRSA和MSSA的種群分子特征及耐藥譜，其中MRSA以ST239-MRSA-Ⅲ占絕對優勢；而MSSA分子型別則呈現出多樣性。ST121等高毒力、多重耐藥菌株的檢出，提示在我國金葡菌感染的防控中，除關注MRSA外，MSSA以其較高的毒力以及越來越嚴峻的耐藥形勢同樣需要給予高度關注。