石墨烯場效應晶體管生物傳感器在醫學檢測中的研究進展

鄭 超 綜述，盧忠心 審校

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院檢驗科，湖北武漢 430014)

醫學檢測的關鍵在于快速準確檢測生物分子，研究建立靈敏度高、特異度好、快速簡便的檢測新方法、新技術、新裝備對于疾病的診斷具有重要意義。納米材料科學技術和電子技術的快速發展助力生物傳感器在醫學檢測中得以廣泛運用，特別是石墨烯場效應晶體管生物傳感器。與傳統檢測技術相比，在核酸、蛋白質、細菌等的檢測方面，石墨烯場效應晶體管具備一定的優勢，主要表現在靈敏度高和選擇性高、分析速度快、免標記、廉價、能夠微型化和一體化等[1]，這些優點助力石墨烯場效應晶體管在生物分子的床旁化檢測中發揮重要作用。

迄今為止，關于石墨烯場效應晶體管在醫學檢測中的研究越來越多。本文簡要綜述石墨烯器件的制備及工作原理，石墨烯的制備及功能化，重點綜述石墨烯場效應晶體管在醫學檢測中的運用，包括核酸、蛋白質、細菌的檢測等。

1 石墨烯場效應晶體管傳感器制備

1.1石墨烯場效應晶體管生物傳感器結構及工作原理 石墨烯的場效應晶體管生物傳感器結構如圖1所示[6]，包括源漏兩極及兩極之間的導電材料石墨烯，基底材料和銀/氯化銀作為柵極，研究者可以在石墨烯上修飾各種生物識別元件檢測生物分子。石墨烯場效應晶體管生物傳感器在醫學檢測中的機理主要有電荷摻雜效應和靜電效應[2-5]。當帶有電荷的生物分子靠近石墨烯表面時會影響石墨烯的電荷密度，從而影響石墨烯器件的導電性或者狄拉克點(電導率最低點)的偏移，通過電學信號的變化對生物分子進行定性或定量檢測。

1.2石墨烯的制備 石墨烯的制備方法主要有微機械剝離法[7]、化學剝離法[8]、化學氣相沉積法[9]。

1.2.1微機械剝離法 即用膠帶對高定向熱解石墨反復剝離制備石墨烯，此法稱為“scotch-tape”法。微機械剝離法制備石墨烯過程復雜繁瑣，但保證了石墨烯結構的完整和質量，更多地被運用于石墨烯器件的本征性能研究。但是微機械剝離法難以控制石墨烯大小、層數和形狀，并且產量很低，難以實現規模化制備，限制了其在傳感器中的應用。

1.2.2化學剝離法 在強酸強氧化劑作用下制備石墨烯的方法稱為化學剝離法，制備得到的石墨烯為氧化石墨烯。化學剝離法簡單、廉價，石墨烯溶液均一穩定，并且能大規模制備。但是由于制備過程對石墨烯的結構產生了很大的破壞，導致電子遷移率低，往往需要通過化學還原或者熱還原等方法去除氧化石墨烯上的含氧官能團，得到導電性能好的還原氧化石墨烯。

圖1 石墨烯場效應晶體管生物傳感器示意圖及傳感原理圖

1.2.3化學氣相沉積法(CVD) 即甲烷和氫氣在高溫的作用下可以在金屬(銅、鉑、鎳等)表面催化生長，該方法可以快速大規模地制備高質量單層石墨烯，但是化學氣相沉積法需要將生長在金屬表面的石墨烯轉移到相應基底上，轉移的過程常常涉及到有機物的使用，因此會影響到石墨烯本征優越性能和后續生物分子的修飾。

1.3石墨烯的功能化 為了保證傳感器件的靈敏度、特異度和穩定性，可以對石墨烯進行功能化修飾。化學剝離法制備的石墨烯含有大量的含氧官能團，如羥基、羧基等，可以利用這些官能團共價修飾生物分子，例如羧基可以與蛋白質的氨基或酯基反應。共價結合方法豐富了生物分子的修飾方法，但石墨烯的本征性能會受到一定影響。微機械剝離法和化學氣相沉積法制備的石墨烯，表面不含有任何官能團，為提高傳感器的檢測性能，同樣可以在石墨烯表面通過共價或者非共價的方式修飾生物分子。由于共價修飾會在一定程度上影響石墨烯的性能，所以非共價修飾更多被運用于石墨烯的功能化。非共價修飾的方法主要有范德華力、π-π堆積、靜電吸附等[10-11]。在石墨烯表面固定納米顆粒也是一種被廣泛運用的非共價修飾方法。

2 石墨烯場效應晶體管生物傳感器在醫學檢測中的應用

2.1核酸檢測

2.1.1DNA傳感器 石墨烯的場效應晶體管生物傳感器被廣泛運用于核酸的檢測。DONG等[12]使用多層CVD石墨烯場效應晶體管檢測DNA，探針DNA通過靜電吸附在石墨烯表面，該器件對DNA的檢測限為10 pM，作者也通過在石墨烯表面沉積金納米顆粒來提高檢測上限。CHEN等[13]報道了使用單層CVD石墨烯作為溝道材料，檢測限比DONG等[12]報道的低一個數量級，這得益于單層石墨烯更大的體表比。ZHENG等[14]在單層CVD基礎上進一步利用電中性的肽核酸(PNA)代替DNA作為識別探針，檢測限進一步低至10 fM。

2.1.2miRNA傳感器 miRNA是一類約18～25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，研究表明miRNA與許多疾病的發生、發展有密切關系，如腫瘤、心血管疾病等。XU等[15]發明了一種石墨烯場效應晶體管陣列傳感器，并且利用該傳感器特異性檢測let-7g，通過鏈霉親和素-生物素的放大作用實現檢測信號的放大，最低檢測到了100 fM的靶標。CAI等[16]在還原氧化石墨烯表面沉積金納米顆粒，用電中性的PNA代替DNA作為探針分子，金納米顆粒及PNA的使用提高了傳感器對miRNA的檢測靈敏度及特異度。

2.2蛋白質的檢測

2.2.1腫瘤標志物的檢測 腫瘤標志物的篩查對于腫瘤的早期發現和診療具有重要意義，因此研究簡單、快速、經濟、有效的方法、技術，對于腫瘤標志物的檢測非常重要。石墨烯場效應晶體管在腫瘤標志物的篩查中具有一定優勢。KIM等[17]將前列腺特異性抗原(PSA)抗體固定在還原氧化石墨烯表面檢測前列腺癌標志物——前列腺特異性抗原-抗糜蛋白酶復合物(PSA-ACT)，當PSA抗體結合PSA-ACT后，狄拉克點發生偏移，根據狄拉克點偏移多少進行檢測，檢測限低至飛摩爾，檢測范圍跨越6個數量級。MYUNG等[18]為了提高傳感器的檢測靈敏度，將二氧化硅納米顆粒(NPs)包裹石墨烯檢測乳腺癌標志物——人表皮生長因子受體2(HER2)和表皮生長因子受體(EGFR)，NPs經3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)處理后表面有帶正電的氨基，可以與帶負電的氧化石墨烯(GO)靜電結合形成GO-NPs，化學還原后形成rGO-NPs。HER2和EGFR抗體被固定在rGO-NPs，該傳感器對HER2和EGFR的檢測限分別為1 pM和100 pM，并且在高濃度的蛋白質干擾下也能檢測到低濃度的靶標，具有很高的特異度。ZHOU等[19]也使用石墨烯場效應晶體管實現了實時檢測腫瘤標志物癌胚抗原(CEA)，傳感器的電流變化越大，CEA的濃度越高，通過電流的變化大小可對CEA進行定量檢測。同樣，最近MANOSOURI等[20]使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)作為柔性基底和羧基化的多壁碳納米管/還原氧化石墨烯作為溝道材料構件場效應晶體管，然后將CA125適配體修飾在溝道上，該適配體傳感器檢測范圍寬(1.0×10-9～1.0 U/mL)，檢測限低(5.0×10-10U/mL)。

2.2.2心血管疾病標志物檢測 腦鈉肽(BNP)是心力衰竭的重要標志物，LEI等[21]將鉑納米顆粒沉積在石墨烯場效應晶體管上，然后將BNP抗體修飾在納米鉑顆粒上，提高傳感器的檢測靈敏度，該傳感器結合微濾系統實現了對全血中BNP的高靈敏度、高特異度檢測，靈敏度達100 fM，其他蛋白質對BNP的檢測幾乎沒有影響，該傳感器有望運用于臨床檢測。WANG等[22]采用微加工工藝實現了規模化制備微米級別的CVD石墨烯場效應晶體管，并將凝血酶適配體通過1-芘丁酸-琥珀酰亞胺酯(PASE)連接劑修飾在石墨烯表面，通過電流的變化實現了實時檢測凝血酶，并且研究了凝血酶適配體與凝血酶的相互作用的情況。

2.2.3免疫球蛋白定量 免疫球蛋白E(IgE)和G(IgG)是人體免疫系統的重要組成部分，它們與過敏、感染、腫瘤等密切相關。OHNO等[23]將IgE適配子修飾在石墨烯表面檢測IgE，IgE的適配子的使用可以增強與IgE的作用和降低反應體系的德拜長度，降低檢測限，因此該傳感器最低能檢測到0.29 nM的IgE。MAO等[24]在還原氧化石墨烯表面修飾金納米顆粒提高檢測靈敏度，抗IgG抗體固定在金顆粒表面檢測IgG，該傳感器的檢測限為0.2 ng/mL。

2.3細菌的檢測 快速、正確鑒定細菌對于疾病的診斷和治療也非常重要。石墨烯場效應晶體管在細菌的檢測中同樣具有很大的優勢與前景。MOHANTY等[25]將化學修飾的石墨烯與細菌整合構建器件，當帶負電荷的革蘭陽性細菌(蠟樣芽孢桿菌)靜電吸附在帶正電荷的石墨烯上時，石墨烯的電導率增大，通過電導率的變化來檢測細菌，遺憾的是靜電吸附的方式導致了該法特異度不高。HUANG等[3]報道了一種高靈敏檢測細菌的傳感器，在CVD石墨烯表面修飾大腸桿菌抗體，當加入的大腸桿菌濃度越大時，電導率變化也越大，檢測靈敏度達10 cfu/mL，其他細菌也沒有對信號產生干擾，特異度很高，該研究團隊進一步運用該傳感器進行抗菌藥物的篩選。最近，CHANG等[26]報道了利用超聲輔助自組裝氧化石墨烯構建傳感器，金納米顆粒被濺射在石墨烯表面，后將大腸桿菌抗體固定在金納米顆粒表面，靈敏度同樣也是10 cfu/mL，雖然靈敏度沒有提高，但是這種方法更加簡單、廉價，可以大規模運用。

2.4其他 外傷患者動脈血中乳酸的水平與病死率有很大關聯，及時檢測患者血中的乳酸水平對降低患者病死率具有重要意義。LABROO等[27]將石墨烯轉移到柔性基底PET上，后將乳酸氧化酶修飾在石墨烯表面檢測血中的乳酸水平，傳感器檢測線性范圍為0.08 M～20 M。HUANG等[28]在石墨烯表面修飾修飾葡萄糖氧化酶和谷氨酸脫氫酶檢測葡萄糖和谷氨酸，檢測限分別為0.1 mM和5 mM。

3 結 論

本文簡要綜述了石墨烯場效應晶體管的結構及工作原理、石墨烯的制備方法、石墨烯的功能化方法及石墨烯場效應晶體管在醫學檢測中的研究進展。石墨烯的優越電學性能，對于構建快速、靈敏、廉價的場效應晶體管檢測系統提供了巨大的優勢，石墨烯制備技術的快速發展更是為制備性能優越的石墨烯場效應晶體管生物傳感器提供了保障。石墨烯場效應晶體管生物傳感器用于醫學檢測目前還處于剛剛興起的階段，轉化為商業診斷器材仍然存在一些問題:(1)對實際樣本的檢測能力不夠，生物傳感器對于血液或者體液中的復雜物質抗干擾能力較差；(2)德拜長度和溝道材料石墨烯有限的面積限制了石墨烯場效應晶體管具備更高靈敏度；(3)如何規模化制備性能均一穩定的廉價石墨烯場效應晶體管及陣列仍然具有很大挑戰。需要解決以上問題可能需要從以下幾個方面入手：(1)研究石墨烯功能化的新方法和發現更多的生物識別元件，提高傳感器檢測靈敏度、特異度及對實際樣本的檢測能力；(2)研究大規模制備低價高質量石墨烯的方法，尋找廉價且不影響器件本身性質的基底。相信在更多研究人員的努力下，石墨烯場效應晶體管能夠在醫學檢測中扮演越來越重要的角色。