NaCl鹽脅迫對洋蔥鱗片葉內表皮細胞凋亡的影響

王鵬洋，付澤元，孫立坤，喬碩

（東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150040）

細胞凋亡即細胞程序性死亡（Programmedcelldeath，PCD），是細胞生物體中一些細胞采用的由自身基因調控通過信號傳導的細胞主動死亡的方式[1]。它涉及一系列基因的激活、表達及調控等作用，不造成炎癥和自體的損傷，是細胞為了更好地適應自下而上環境而主動爭取的死亡過程[2]。細胞凋亡是細胞重要的生命活動特征，在生物體的進化、內環境的穩定及多個系統的發育中起著重要作用[3-4]。對細胞凋亡的研究最早始于動物細胞，植物細胞凋亡研究起步較晚。植物細胞凋亡存在于植物體正常生長發育的各個階段，是植物體抵御病原體和抵抗逆境的重要手段[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為新鮮的洋蔥，取其鱗片葉內表皮，現用現取，保持新鮮濕潤。

1.2 方法

1.2.1實驗設計

設計處理材料的NaCl濃度梯度和時間梯度：濃度設為5個梯度：0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L；時間設為 3 個梯度：0.5h、1h、2h。

1.2.2材料處理

將配置好的不同濃度的NaCl溶液分裝到2ml離心管中，每小管中裝1ml，每濃度梯度5管備用；連洋蔥肉帶內表皮切洋蔥小塊，面積約0.5cm×0.5cm，將洋蔥小塊泡入離心管溶液中。后開始計時，分別在0.5h、1h、2h時從每個濃度梯度的離心管中取出一塊洋蔥塊，撕下洋蔥鱗片葉內表皮置于載玻片上。設置對照組，即直接固定染色制片的一組。

1.2.3裝片制作與觀察

卡諾固定液固定15分鐘，95%酒精處理5分鐘，70%酒精處理5分鐘，清水將酒精洗去，3%甲基綠∶派洛寧=3∶1，染色30分鐘，用清水洗去染料浮色，用分析純丙酮漂洗5秒，再用清水洗去丙酮，蓋上蓋玻片后用吸水紙洗去多余水分，后用光學顯微鏡鏡檢觀察。觀察細胞凋亡情況與形態特征變化，對觀察結果進行拍照，并計算細胞凋亡率。

細胞凋亡率=細胞凋亡數/視野中細胞總數×100%[7]。

1.2.4數據分析

用MicrosoftExcel和Origin軟件對實驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 對照組細胞形態結構觀察結果

空白對照組在NaCl處理Oh的細胞形態結果如圖1所示，細胞整體形態飽滿且輪廓分明；細胞膜完整，緊貼細胞壁；細胞核呈完整的圓球形狀，染色均勻，視野中沒有已經凋亡的細胞。

2.2 不同濃度NaCl處理0.5h后，細胞形態結構觀察結果

從圖2中可見，在不同濃度的NaCl處理0.5h后，洋蔥內表皮細胞發生不同程度的質壁分離，細胞壁依然完整，可以看到清晰的細胞壁輪廓；隨著濃度的升高，質壁分離越明顯，細胞膜皺縮程度越高，直到濃度較高的實驗組有細胞膜破裂的現象出現，有的細胞正處于凋亡的過程中，可見凋亡小體；細胞核在濃度高的實驗組中不完整，染色質邊緣化貼近細胞膜。

圖1對照組細胞形態結構圖

2.3 不同濃度NaCl處理1h后細胞形態結構觀察結果

從圖3中可見，在不同濃度的NaCl處理1h后，細胞質壁分離程度較0.5h實驗組的相比其程度不再加大；NaCl濃度為0.1mol/L和0.2mol/L的實驗組與處理0.5h相比總體變化不大，細胞膜沒有破碎痕跡，沒有出現凋亡小體，細胞核清晰球狀沒有大的變化；0.5mol/L實驗組處理1h的比0.5h的細胞膜破裂的細胞數量增多，存在凋亡小體的細胞數目也增多；1mol/L和2mol/L實驗組中細胞膜破碎程度加大，更多的細胞核邊緣界限模糊不清晰且不完整。

2.4 不同濃度NaCl處理2h后細胞形態結構觀察結果

從圖4可見，處理2h后，總體染色加深，細胞質呈明顯紅色，細胞核綠色加深；0.1mol/L和0.2mol/L的實驗組依然沒有出現細胞凋亡現象，但是發現細胞核染色加深；0.5mol/L實驗組中發現質壁分離現象較先前實驗較明顯，可見一些細胞正處于凋亡中，存在凋亡小體；1mol/L和2mol/L的實驗組中，細胞進一步凋亡，細胞背景較之前不干凈，有些細胞已經凋亡完成或接近凋亡完成的狀態，導致細胞質膜極度殘缺。

2.5 不同濃度與處理不同時間的細胞凋亡率統計分析

從圖5中可見，隨著NaCl濃度的升高，細胞凋亡率呈上升趨勢，且趨勢大致相同，濃度在0.1mol/L和0.2mol/L實驗組中細胞凋亡率較低，該濃度還不至于引起細胞凋亡，濃度在0.2mol/L和1mol/L之間變化時，其凋亡率增加最快，隨后凋亡率增加趨勢再趨于平緩；縱向觀察，隨著誘導時間的增加，凋亡率有明顯的增加，在濃度為2mol/L處理時間2h的實驗組中，凋亡率已經趨近于100%。

3 討論

圖2不同濃度NaCl處理0.5h后細胞形態結構圖

圖3不同濃度NaCl處理1h后細胞形態結構圖

圖4不同濃度NaCl處理2h后細胞形態結構圖

圖5細胞凋亡率統計圖

顯微觀察結果表明，NaCl可以誘導洋蔥鱗片葉內表皮細胞凋亡，細胞凋亡的形態變化是相似的，過程是多階段的。主要包括：細胞核濃縮、邊緣化、質膜卷曲、質壁分離、細胞核消失，直至細胞膜反折，最終形成凋亡小體[8]。得到結論：NaCl濃度越高其誘導細胞凋亡的能力越強；誘導時間越長，其細胞凋亡率越高。在動物細胞中很容易觀察到凋亡小體，而植物細胞中很難觀察到[9]。有研究表明，細胞凋亡與caspase（胱冬酶）有關，其為信號誘導，激活caspase，后產生級聯放大效應，最后導致細胞凋亡[10]。實驗結果得到，濃度在0.2mol/L和1mol/L之間的凋亡率激增，預測在這個濃度范圍內可以觀察到更多正處于凋亡過程的細胞，下一步實驗要在濃度0.2mol/L和1mol/L之間分設梯度，從而更清楚地觀察洋蔥細胞正處于凋亡過程中的形態結構變化。