高效降解棉籽粕中游離棉酚菌株的篩選及復配發酵方式的優化

亓秀曄 謝全喜 于佳民 趙 倩 張志焱 徐海燕 谷 巍

(山東寶來利來生物工程股份有限公司，泰安 271000)

隨著我國畜牧業的快速發展，飼料的需求越來越大。棉籽餅(粕)是我國除豆粕以外的一種優質的植物性蛋白飼料，因此棉籽粕的開發利用是解決我國蛋白質資源短缺的主要途徑之一。我國每年可生產600多萬t棉籽粕，而使用量僅為30%，資源浪費嚴重[1]，這是由于棉籽餅中含有棉酚、環丙稀脂肪酸、單寧等有毒物質，制約了其在畜牧業中的應用。其中最主要的是棉酚。棉酚的存在形式有2種，即結合棉酚和游離棉酚。結合棉酚在機體消化系統中不被吸收，可很快隨糞便排出體外，毒性很低。游離棉酚分子結構中的活性基團(醛基和羧基)對動物毒性很大，長期飼喂動物過多的未經脫毒的棉籽粕飼料，棉酚含量會在動物體內蓄積，引發中毒，棉酚中毒的表現在所有動物中是相似的，均會導致動物出現急性呼吸窘迫臨床癥狀，厭食乏力，甚至死亡等[2-3]。大量動物實驗如羊、豬和肉雞等表明，棉酚在動物體內各器官中的殘留是不均勻的，最先在肝臟中蓄積，其次是膽汁、腎、脾和血液，而淋巴結、心、肺、膈肌和胰中的含量較低[4]。飼料中游離棉酚可以在不同畜禽體內殘留，并轉移到人們可食用的畜產品中[5]。

棉粕的脫毒方法主要有物理法、化學法和微生物發酵法等，其中微生物發酵法是目前普遍認為的成本低、效果好、較安全的脫毒方法[6-8]。研究表明，微生物發酵能有效降解飼料中的抗營養因子，促進養分的消化吸收，改善動物健康，減少飼用抗生素(促生長)的使用[9]。微生物發酵棉籽餅脫毒的關鍵是菌種的選擇，不同微生物菌種對棉酚的降解能力不同，篩選優良的微生物菌種是影響棉籽粕脫毒效果的首要條件。選取合適的微生物進行飼料的發酵能有效降解飼料中的抗營養因子，促進養分的消化吸收，分泌的代謝產物如小肽、有機酸等利于改善動物健康[10-12]。目前，國內外研究發現可降解棉籽粕中游離棉酚的微生物主要有假絲酵母、黑曲霉、稻根霉菌、魯氏毛霉甚至還有黃曲霉等真菌、芽孢菌和乳酸菌等細菌。但是這些菌單獨發酵時存在一些不足，比如霉菌在動物飼料中使用的安全性仍然被懷疑；芽孢菌在氨基酸代謝中會發生脫羧或脫氨作用，產生刺鼻的氨，影響發酵風味；乳酸菌降解棉酚效果不顯著等。實際生產中真菌和細菌對營養物質的利用存在一定的差別，如果利用安全的真菌和細菌聯合發酵棉籽粕或許可以更有利于棉籽粕中棉酚的降解。本研究旨在利用酵母菌和乳酸菌對棉籽粕進行固態發酵，以降低棉酚含量，提高棉粕蛋白利用率，改善棉粕品質，具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發酵基料及菌株

棉籽粕由新疆泰昆生物集團提供，粉碎過40目篩。

酵母菌(Yeast)菌株：BLCC4-0327、BLCC4-0021、BLCC4-0018、BLCC4-0048，乳酸桿菌(Lactobacillus)菌株：BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0112和BLCC2-0111；均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD)培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

MRS培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母膏4 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟南匯豐達化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實業有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80、氫氧化鈉、氫氧化鈉、磷酸、氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司；磷酸二氫鉀：天津市致遠化學試劑有限公司；試劑均為分析純。乙腈、丙酮、甲醇(均為色譜級)：天津市永大化學試劑有限公司；微孔濾膜(直徑13 mm、孔徑0.22 μm)：上海安譜有限公司；棉酚標準品(純度98%)：上海源葉生物科技有限公司。蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9082電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司；LDE-2A低速離心機：北京時代北利離心機有限公司；SHB-ⅢS循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE52CS旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SB1200 超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；LC-20AT液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌和乳桿菌發酵液的制備

將4 ℃條件下保存的酵母斜面活化，轉接到裝有50 mL YEPD培養基的三角瓶中，30 ℃搖床振蕩培養16 h備用；將4 ℃條件下保存的乳桿菌斜面活化，轉接到裝有100 mL MRS培養基的鹽水瓶中，37 ℃培養箱靜置培養24 h備用。

1.3.2 實驗設計

1.3.2.1 酵母菌的篩選

稱取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1∶0.4 (m/V)，裝量50 g/瓶，按2%接種量分別接入培養好的酵母菌種子液，每個樣品設3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，置于30 ℃培養箱進行需氧發酵，分別于發酵24 h和48 h取樣，測定活菌數、酸溶蛋白和游離棉酚含量。

1.3.2.2 乳桿菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比1∶0.4 (g∶mL)配制好，以袋量為100 g/袋裝袋，每個樣品設3個平行，分別按照2%接種量接入培養好的乳桿菌發酵液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37 ℃培養箱進行生料厭氧發酵，分別于發酵24 h和48 h取樣，測定pH值、活菌數、酸溶蛋白和游離棉酚含量。

1.3.2.3 混菌發酵

將篩選得到的酵母菌和乳桿菌進行混菌發酵，發酵方式為厭氧發酵，料水比為1∶0.4(g ∶mL)，以裝袋量為100 g/袋裝袋，接種量2%，乳桿菌∶酵母菌(3∶2)，生料發酵，30 ℃培養箱培養。以不接種任何菌株的空白料為對照，分別于發酵24 h和48 h取樣，測定pH值、活菌數、酸溶蛋白和游離棉酚含量。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 pH測定

取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

1.4.2 乳桿菌和酵母菌活菌數的測定

準確稱取發酵棉粕10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當稀釋度的樣品分別至LBS培養基和孟加拉紅培養基中，分別于37 ℃和30 ℃培養48 h，根據菌落數計算樣品中乳桿菌和酵母菌數量，結果用CFU/g表示。

1.4.3 酸溶蛋白含量的測定

準確稱取2.00 g發酵棉籽粕于25 mL具塞試管中，加入15%三氯乙酸溶液10 mL，混合均勻，靜止5 min，定容至25 mL，每隔2 min混勻1次，共計時30 min。將溶液定量轉移，抽濾，取濾液10 mL，轉入消化管中，加入3 g混合催化劑(硫酸鉀∶無水硫酸銅=15 ∶1)，與濾液混合均勻，再加入7～8 mL濃硫酸，將消化管置于消化爐中420 ℃消化，待消化液呈透亮的藍綠色時，繼續消化40 min，按照凱氏定氮法測定上清液中可溶性蛋白質含量。另準確稱取2.00 g發酵棉籽粕，采用凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白含量。

酸溶蛋白含量=(上清液中可溶性蛋白質含量×25/10)/樣品中粗蛋白含量×100%。

1.4.4 游離棉酚含量的測定[13]

棉酚標準溶液的配制：準確稱取棉酚標準品，用乙腈- 0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶解得1.21 mg/mL的標準品儲備液，標準儲備液再用乙腈-0.2%磷酸(體積比為85∶15)稀釋成121 μg/mL的標準品工作液。用流動相將標準品工作液逐級稀釋得到濃度分別為61.50、20.17、5.04、2.52、1.21 μg/mL的標準工作液，濃度由低至高進樣測定，以峰面積和濃度作圖，得到標準曲線回歸方程為：Y=0.000 005 45X+ 0.160 525(R2=0.999 965 2)，線性范圍為1.21～121 μg/mL。參照GB 5009.148—2014規定利用高效液相色譜法檢測[14]，植物油體樣品取樣1.0 g 時，檢出限為2.5 mg/kg ，定量限為7.5 mg/kg；以棉籽餅為原料的水溶性液體樣品取樣10 g 時，檢出限為0.25 mg/kg，定量限為0.75 mg/kg。

待測樣品游離棉酚的提?。簻蚀_稱取待測樣品3.00 g，加入丙酮30 mL，超聲提取30 min，25 ℃下3 000 r/min離心10 min，重復提取3次，合并上清液。將上清液全部轉移至蒸發瓶中，旋轉蒸發至干，用乙腈- 0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶液溶解，多次超聲清洗轉移至25 mL容量瓶，定容，過0.22 μm濾膜后供HPLC測定。

HPLC法測定游離棉酚含量：色譜條件為色譜柱IntertsilR ODS-2(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈- 0.2%磷酸(體積比為85∶15)溶液，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長235 nm，進樣量20 μL，柱溫25℃。

1.4.5 棉酚標準曲線的繪制

由棉酚標準品的HPLC色譜圖(圖1，棉酚標準品質量濃度6.15 μg/mL)，可以看出，在5.686 min左右出棉酚色譜峰，且穩定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高。由圖2可以看出，棉酚標準曲線線性吻合良好、定量范圍廣、定量限低、準確度和靈敏度高，該方法可用于準確測定游離棉酚的含量。

圖1 棉酚標準品的HPLC色譜圖

圖2 游離棉酚的標準曲線

1.5 數據分析

數據用Excel 2007進行初步處理后，采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進行方差分析，LSD法進行組間多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 酵母菌的篩選

由表1可知，發酵24 h時，各酵母菌菌株均能夠成功發酵棉籽粕，各組發酵棉籽粕中酵母菌活菌數均在幾億水平，差異不顯著；與空白對照組相比，各菌株發酵均顯著提高了發酵棉籽粕中酸溶蛋白含量(P<0.05)，其中以菌株BLCC4-0327發酵時最高，四組酵母菌發酵組間差異不顯著(P>0.05)，BLCC4-0327組的酸溶蛋白含量較空白對照組高出23.20%。以BLCC4-0327組發酵棉籽粕游離棉酚含量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，其游離棉酚降解率達到72.72%，其次是BLCC4-0018組，BLCC4-0048組游離棉酚降解率最低。

表1 不同酵母菌發酵棉粕對飼料品質的影響

注：游離棉酚降解率=[(空白對照組樣品游離棉酚含量-發酵組樣品游離棉酚含量)/空白對照組樣品游離棉酚含量]×100，余同。

發酵48 h時，各組發酵棉籽粕中酵母菌活菌數升高，以BLCC4-0327較高，但差異不顯著。BLCC4-0327組的酸溶蛋白含量最高，顯著高于高于其他酵母菌發酵組(P<0.05)。以BLCC4-0327組發酵棉籽粕游離棉酚含量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，其游離棉酚降解率達到81.83%，其次是BLCC4-0018組，BLCC4-0048組游離棉酚降解率最低。綜上可知，酵母菌BLCC4-0327在提高發酵棉籽粕的酸溶蛋白含量和降低游離棉酚含量方面效果最好。

2.2 乳酸菌的篩選

由表2可知，5個乳酸菌發酵組中，發酵24 h時除BLCC2-0112組發酵棉籽粕中乳酸菌活菌數較低外，其他乳酸菌發酵組間差異不顯著(P>0.05)，均在幾十億水平，發酵48 h 時仍以BLCC2-0112組發酵棉籽粕中乳酸菌活菌數最低，顯著低于其他乳酸菌發酵組(P<0.05)；無論是發酵24 h還是發酵48 h時，發酵棉籽粕的pH均以BLCC2-0092和BLCC2-0001組最低，其次是BLCC2-0015組，這3組在發酵48 h時pH均降至5.00以下，其中BLCC2-0092組在發酵48 h時pH降至4.67。從降低發酵棉籽粕的pH來看，5株乳酸菌中以菌株BLCC2-0092、BLCC2-0001和BLCC2-0015發酵棉籽粕較好，最優為菌株BLCC2-0092。

表2 乳酸菌發酵對棉粕品質和游離棉酚含量的影響

表3 酵母菌和乳酸菌復配發酵對飼料品質的影響

2.3 酵母菌和乳酸菌的復配發酵

由表3可以看出，各復配菌株發酵組各發酵階段發酵棉籽粕中酵母菌活菌數均達到或接近億水平，乳酸菌活菌數達到幾十億水平，與同時間段下菌株單獨發酵時相比有所降低。綜合各項指標來看，2個復配菌株發酵組中以BLCC4-0327+ BLCC2-0092組最優。與空白對照組相比，BLCC4-0327+ BLCC2-0092組各發酵階段的發酵棉籽粕的pH均顯著降低(P<0.05)，發酵24 h時pH降至5.73，發酵48 h時pH降至5.64，這高于乳酸菌單獨發酵時的pH，但顯著低于酵母菌單獨發酵時(數值未列出，酵母菌發酵pH變化不大，均在6.50以上)。各復配菌株發酵組各發酵階段發酵棉籽粕的游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)，游離棉酚降解率均在60%以上，優于乳酸菌單獨發酵時。發酵24 h時，BLCC4-0327+BLCC2-0092組游離棉酚降解率達到70.99%，發酵48 h時游離棉酚降解率達到73.44%，這個數值稍低于酵母菌BLCC4-0327單獨發酵時。

各復配菌株發酵組發酵棉籽粕的酸溶蛋白含量顯著提高，發酵24 h時BLCC4-0327+ BLCC2-0092組酸溶蛋白質量分數達到14.61%，這比BLCC4-0327單獨發酵時提高了82.17%，比BLCC2-0092單獨發酵時提高了122.71%；發酵48 h時酸溶蛋白質量分數達到17.61%，這比BLCC4-0327單獨發酵時提高了111.91%，比BLCC2-0092單獨發酵時提高了176.45%。

3 討論

利用微生物發酵棉籽粕，在使其游離棉酚含量的安全性大大提高的同時，還可以提高棉籽粕的營養價值如改善蛋白質含量及發酵風味等，增加其在動物飼糧中的添加量，提高棉籽粕的利用率[15-16]。發酵、酶解粕類和植物蛋白質源的主要目的是將其中的大分子蛋白質降解成為小分子蛋白質，甚至降解成多肽和小肽，從而促進蛋白質的合成，促進礦物質元素的吸收利用，提高動物機體的免疫機能以及動物的生長速率和生產性能。研究表明，使用酸溶蛋白質含量指標評價發酵、酶解粕類蛋白質品質，既可以反映其中抗原蛋白質和其他蛋白質抗營養因子被水解的程度，進而揭示該類抗營養因子活性被消除的程度，又可在一定程度上反映肽含量的高低[17-18]。

酵母菌是人類利用較早的一大類真核微生物，它是研究真核生物的模式菌株；此外，酵母菌還具有脫毒作用，主要表現在兩個方面：一方面是酵母菌對真菌毒素、細菌內毒素及其他有害有毒物質具有減毒或脫毒作用；另一方面為酵母菌細胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白參與了生物脫毒過程，酵母菌細胞壁也作為高效脫毒劑得到了應用[19]。有關酵母菌發酵棉籽粕脫毒效果的研究有很多，但大都需要較復雜的條件，或是需要較大的接種量或是培養基需要另添加底物。如程福亮等[20]以產朊假絲酵母為發酵菌種，在溫度為30 ℃、發酵底物含水量為37%和接種量5%的條件下進行固態厭氧發酵，發酵36 h 降解棉酚率為85.7%；周慧林等[21]對釀酒酵母、產朊假絲酵母和熱帶假絲酵母3種酵母棉酚的培養基上的生長能力進行了比較，發現產朊假絲酵母降解棉酚能力強，在接種107水平，30 ℃發酵24 h時棉酚含量下降了55.6%。陳生琴等[22]發現以醋酸棉酚為唯一碳源，分離篩選到的一株高效降解棉酚菌株RE-1，在最優發酵條件為溫度34 ℃、時間8 d、pH5.0、料水比1∶0.5、接種量20%時，發酵棉籽粕中棉酚的降解率達到72.54%；張文舉等[23]發現，在棉籽餅發酵底物中需要額外補充糖類、尿素或是硫酸亞鐵等，才可以降低發酵料的棉酚含量。在本研究中，酵母菌BLCC4-0327單獨發酵棉籽粕，2%接種量，30 ℃發酵24 h時，游離棉酚降解率可達到72.72%，同時發酵料的酸溶蛋白含量較空白對照組提高23.02%(P<0.05)，優于文獻中報道。

乳酸菌在發酵過程中產生乳酸、乙酸、丙酸和細菌素等多種物質，這些物質除具有殺毒抑菌作用外，還具有維持腸道內菌群平衡、抑制病原菌微生物生長、調節胃腸道功能等作用，同時餅粕類飼料經乳酸菌發酵后，有特殊的酸甜芳香氣味，pH下降，能有效改善飼料的適口性[24]。劉建成等[25]研究發現一株德氏乳桿菌固態發酵棉粕產有機酸含量達到25.64 g/kg，比優化前提高了39.65%；乳酸菌固態發酵酶解豆粕、棉籽粕和菜籽粕均能有效提高粗蛋白質含量，降低pH，使酸度增加；有效降解棉籽粕中單寧及菜籽中異硫氰酸酯和唑烷硫酮，而對游離棉酚及植酸的降解能力有限[26]。這也與本研究結果一致，本研究發現幾株乳酸菌均不具有降解棉酚的能力，但可以降低發酵棉籽粕的pH，乳酸菌BLCC2-0092發酵24 h時，發酵棉籽粕 pH 降至5.47。因此，本研究利用酵母菌和乳酸菌復配發酵棉籽粕，在降低發酵棉籽粕中游離棉酚含量的同時，改善發酵風味，大幅度提高飼料營養價值。

混菌發酵的效果優于單菌發酵。諸葛斌等[27]利用黑曲霉P1和枯草芽孢桿菌H1按照2∶1比例混菌發酵，發酵后棉粕小肽含量可提高18.36%；喬曉艷等[28]利用熱帶假絲酵母JD-9和甘酪乳桿菌MX-48發酵棉粕，發酵后游離棉酚脫毒率達到48.1%，棉粕中小肽含量提高14.43%；劉惠琴等[29]從棉籽殼中分離出一株能降解游離棉酚的細菌M2，產朊假絲酵母與M2 的混合接種比為7∶3，發酵溫度32.5 ℃，發酵時間54 h，底物初始含水量75%，pH自然，在此條件下游離棉酚的降解率最高，達到53.021%。本研究中，將降解游離棉酚效果最好的酵母菌和降低 pH 效果最好的乳酸菌復配發酵，與空白對照組相比，最優復配發酵組(BLCC4-0327+ BLCC2-0092組)各發酵階段的發酵棉籽粕的pH均顯著降低(P<0.05)，發酵24 h時pH降至5.73；游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)，發酵24 h時游離棉酚降解率達到70.99%，發酵48 h時游離棉酚降解率達到73.44%，但這兩個指標并沒有超越乳酸菌和酵母菌單獨發酵時的效果。分析原因可能是由于接種比例問題，在發酵過程中導致兩種菌生長狀態不一致[30]，酵母菌生長旺盛會抑制產酸，導致pH降低沒那么明顯；產酸量過高會抑制酵母菌生長，而酵母菌是降解游離棉酚的有效菌株，從而導致混菌發酵的游離棉酚降解率沒有酵母菌單獨發酵時高，但總體差異不顯著。整體來看，混菌發酵優于單菌，主要體現在酸溶蛋白方面：最優復配發酵組(BLCC4-0327+BLCC2-0092組)發酵24 h時BLCC4-0327+ BLCC2-0092組酸溶蛋白質量分數達到14.61%，這比BLCC4-0327單獨發酵時提高了82.17%，比BLCC2-0092單獨發酵時提高了122.71%；發酵48 h時酸溶蛋白質量分數達到17.61%，這比BLCC4-0327單獨發酵時提高了111.91%，比BLCC2-0092單獨發酵時提高了176.45%。

4 結論

利用酵母菌和乳酸菌發酵棉籽粕，篩選出可高效降解游離棉酚的酵母菌BLCC4-0327，可改善發酵風味的乳酸菌BLCC2-0092。結果表明，最優復配發酵組為BLCC4-0327+BLCC2-0092(1∶1)，30 ℃厭氧發酵。與空白對照組相比，最優復配發酵組各發酵階段的發酵棉籽粕的pH均顯著降低(P<0.05)；酸溶蛋白含量顯著提高(P<0.05)；游離棉酚含量顯著降低(P<0.05)。