功能性紅曲Monacolin K產量控制策略的研究進展

于卓然，洪厚勝，2*

1(南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京，211816) 2(南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇 南京，210009)

Monacolin K(莫納可林 K)是紅曲菌的次級代謝產物。紅曲菌在我國有悠久的生產和應用歷史，但一般僅用作天然色素、釀酒、制作腐乳以及中藥[1]。近年來，隨著生活水平的不斷提高，由高膽固醇所引起的冠心病、高血脂、腦血栓、前列腺癌等疾病已威脅著人類的健康，降脂類產品的需求日益增多，由紅曲菌天然發酵的以降膽固醇物質莫納可林K為主要成分的功能性紅曲漸漸走進人們的視野。研究表明，與從其他菌類提取或人工合成的洛伐他汀相比，紅曲產品中的莫納可林K結晶少、溶解度高，因而療效更顯著，毒副作用更小[2]。功能性紅曲中還含有γ-氨基丁酸、膽堿、麥角固醇、黃酮、不飽和脂肪酸等多種對人體有益的活性物質[3]。由于紅曲固態發酵莫納可林K的產率遠高于液態發酵，目前固態發酵仍然是功能性紅曲的常用生產方法，隨著國內紅曲市場以及歐美和日本對我國紅曲產品的需求日益增大，如何有效提高功能性紅曲固態發酵莫納可林K的產量已成為紅曲發酵產業發展中必須解決的重要問題。

1 紅曲菌簡介

紅曲，古稱丹曲，是由紅曲菌科真菌紅曲菌的菌絲體寄生在大米上所制成的，既是食品，也是具有降血壓降血脂功能的傳統中藥[4]。我國對于紅曲的生產和應用已經有一千多年的歷史，最早始于唐代，在明代李時珍的《本草綱目》、宋應星的《天工開物》中，都詳細記載了紅曲的制作方法[5]。按照真菌學的分類方法，紅曲菌屬真菌界(Eumycophyta)、子囊菌門(Ascomycota)、真子囊菌綱(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、紅曲菌科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus)[6-7]。紅曲菌主要由分生孢子、子囊孢子和菌絲體組成，菌絲分枝繁雜，且具有橫隔。菌落形態以在麥芽汁瓊脂培養基上為例，菌絲生長初期為白色，成熟衰老后漸漸變為淡紅色或紫紅色等，因不同品種而異，菌落結構呈絨氈狀或皮膜狀[8]。

2 紅曲的降膽固醇活性物質莫納可林K

1979年遠藤章教授[9]從紅曲菌的次級代謝產物中提取了一種可有效抑制膽固醇合成的活性物質，并命名為莫納可林K。1980年美國學者ALBERTS[10]在土曲霉中發現了同樣具有抑制膽固醇作用的活性物質mevinolin，后被稱作洛伐他汀(lovastatin)。后經研究證明，二者為結構相同的同一種物質。此后科學界又從紅曲菌的代謝產物中發現了多種莫納可林類物質，包括Monacolin J、Monacolin L、Monacolin M、Monacolin X以及最近由ZHANG等[11]發現的新型莫納可林類似物Monacolin T、Monacolin U、6a-O-methyl-4,6-dihydromonacolin L、6a-O-ethyl-4,6-dihydromonacolin L等，而這些物質都需要轉化為莫納可林K才能夠對膽固醇的合成起抑制作用。

莫納可林K以酸式和內酯式兩種結構形式存在，酸式莫納可林K的結構與人體內膽固醇合成途徑中的HMG-CoA的結構相似，能與限速酶HMG-CoA形成競爭性抑制，從而抑制膽固醇的合成[12]。內酯式莫納可林K則需要被人體內的羧基酯酶轉化為酸式結構，才能夠發揮降膽固醇的作用[13]。

3 紅曲菌發酵莫納可林K產量的控制策略

選育高產莫納可林K菌種、優化培養基、控制環境因子都是提高紅曲菌發酵莫納可林K產量的傳統方法，這些方法與紅曲固態發酵工藝過程緊密相關，效果顯著，實施簡單且成本較低，也是目前提高莫納可林K產量策略的主要研究方向。對于莫納可林K代謝途徑的控制，則是從分子水平上控制莫納可林K的合成，是高產莫納可林K研究的新熱點，但是對于基因改造菌株的安全性評估仍然難以實現，還需要更進一步的研究[14-15]。

3.1 高產Monacolin K菌株的選育

近年來國內外對于高產莫納可林K紅曲菌菌種的選育進行了大量研究。常聰[16]等通過紫外-氯化鋰復合誘變法對紅曲菌菌株進行了誘變，篩選出高產莫納可林K和紅曲色素的紅曲菌菌株QH12，其莫納可林K的產率為原始菌株的4.67倍，達到了1.68 mg/g，但是仍未達到《中國藥典》規定的紅曲質量標準。劉穎等[17]從不同的紅曲產品中分離純化出了96株紅曲菌菌株，并通過分子生物學手段篩選出1株高產莫納可林K的紅曲菌株NW3-2，固態發酵產物中酸式莫納可林K含量為3.20 mg/g，內酯式莫納可林K含量為2.47 mg/g，此菌株的莫納可林K產量較高，但其中無法直接利用的內酯式莫納可林K所占比例較高，可進一步優化發酵工藝提高酸式莫納可林K的含量。郎天丹等[18]利用正負電子對撞機的E2束流線打靶技術誘變選育出兩株高產莫納可林K的紫色紅曲菌株M1-20和M2-4，其原理是利用正負電子對撞機的E2束流線打靶產生的高能混合粒子場對菌株進行輻照，進而使菌株發生突變。祁田甜等[19]通過常壓室溫等離子體誘變技術選育出突變紫色紅曲菌株23，其莫納可林K的產量達到了428.14 mg/L，較初始菌株提高了111%。雖然選育高產莫納可林K的菌株可以從源頭上提高紅曲菌發酵產莫納可林K的產量，但是紅曲菌次級代謝產物中的主要有害物質桔霉素與莫納可林K同屬于聚酮合酶途徑，在莫納可林K產量增加的同時常常也會導致桔霉素含量的增加，因此在選育高產莫納可林K菌株的同時也應注意其桔霉素的產量。

3.2 優化培養基

對于固態發酵培養基的優化的傳統方法主要集中在發酵過程中的碳源、氮源、金屬鹽和前體物質的優化，陳慎等[20]通過單因素試驗結合響應面分析后得出外加營養成分為：甘油1.00%，蛋白胨3.10%，檸檬酸三鈉0.13%，此培養基發酵的莫納可林K產量可達2.87 mg/g，但是此類對于培養基成分含量的基礎優化提高的莫納可林K產量往往不高。紅曲菌發酵基質的研究是近年來研究的熱點，有些發酵基質不僅可以提高功能性紅曲莫納可林K的產量，也為功能性紅曲發酵產品的多樣性提供了新思路。ZHANG等[21]使用不同谷物進行了固態發酵實驗，發現小米作為培養基質時,莫納可林K產量最高，其產量達到了7.12 mg/g，此外還對其他發酵條件以及外加碳源氮源等進行了優化，使小米培養基在最佳條件下莫納可林K產量達到了19.81 mg/g，極大地提高了莫納可林K的產量。SHARMIN等[22]研究發現，用褐海藻Saccharinajaponica作為發酵基質，在最佳條件下莫納可林K產量可以達到13.98 mg/g，而且經檢測發酵出的莫納可林K具有較高的熱穩定性、SOD含量以及膽固醇抑制活性。盧穎等[23]用燕麥作為發酵基質制成了燕麥紅曲，在最佳條件下得到的莫納可林K含量達到了15.00 mg/g，而且其中淀粉含量為零，這就使得燕麥紅曲可以作為糖尿病患者功能性食品。車鑫等[24]選擇了15種常見藥材分別加入到培養基中進行試驗分析，發現陳皮粉、山楂粉、山楂汁、桑葉粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉的加入均對紅曲發酵產莫納可林K有促進作用，其中添加陳皮粉發酵的紅曲效果最好，莫納可林K產量為2.118 mg/g，中藥成分作為發酵基質的研究為進一步提升傳統紅曲藥食兩用功能提供了新的思路。培養基的優化，尤其是發酵基質的研究有利于開發出更多的紅曲發酵產品，而且對于莫納可林K發酵產量和質量的提高往往極其顯著，具有廣闊的研究前景。

3.3 改變環境因子

環境因子包括溫度、光照、pH值、發酵時間等，都能對紅曲菌發酵莫納可林K的產量產生影響，通過對這些工藝參數的控制與優化也是提高莫納可林K產量的控制策略之一。溫度是微生物生長的一種基本環境因素，溫度可以影響真菌的生長和其次級代謝產物的生成，MASATOSHI等[25]研究表明，先以最適溫度30 ℃發酵紅曲，而后轉為20 ℃條件下變溫發酵的紅曲莫納可林K產量遠高于一直以30 ℃恒溫發酵的紅曲，變溫發酵莫納可林K的含量是恒溫發酵的20倍，其原因是在低溫時紅曲菌經變溫刺激由生長轉為穩定期，次級代謝產物開始大量生成。光照作為自然界主要的環境因素，對于許多微生物次級代謝產物的生理合成都具有調節作用，研究表明，不同波長的光線能夠影響紅曲菌的次級代謝[26-27]。張杰[28]通過實驗發現，黑暗條件下紅曲菌莫納可林K的產量是藍光照射條件下的2.3倍，相對于黑暗環境，藍光會抑制莫納可林K的生成。楊建等[29]對pH值在紅曲發酵產莫納可林K過程中的影響進行了研究，研究發現在初始pH為6.5時，莫納可林K含量最大，從而確定最佳初始pH為6.5(自然水)，補水pH為5時，莫納可林K含量達到最大值13.36 mg/g。趙秀舉等[30]通過正交試驗設計研究了高溫與低溫發酵時間對紅曲菌發酵莫納可林K的影響，并優化了功能性紅曲菌的發酵條件，優化條件為裝料量360 g/L，高溫35 ℃發酵5 d，低溫22 ℃發酵15 d莫納可林K產量可達24 mg/g。對環境因子的工藝優化可以與高產菌種選育和培養基優化結合，綜合多種策略提高莫納可林K的產量。

3.4 控制莫納可林K的代謝途徑

控制莫納可林K的代謝途徑是從分子水平上控制莫納可林K的代謝合成[31]。一方面是通過運用蛋白組學和基因組學等方法分析莫納可林K的代謝途徑和合成相關基因，再通過基因改造或添加能夠使相關基因抑制表達或過表達的添加物，達到控制莫納可林K合成途徑的目的[32-33]。LIN等[34]以紅曲菌次級代謝產物莫納可林K生物合成相關基因中的mokE基因為目的基因，構建了mokE基因過表達紅曲菌菌株，經測定有3株mokE基因表達量增加，與野生型紅曲菌莫納可林K的產量1.448 mg/g相比分別提高了49.2%、132.5%和188.5%，這說明mokE基因過表達能夠提高紅曲菌莫納可林K的產量，在對其孢子、菌絲掃描電鏡觀察后推測，mokE基因過表達可能是通過影響紅曲菌的孢子和菌絲體的生長從而影響次級代謝莫納可林K的產生。JING HUANG等[35]通過加入亞油酸使紅曲菌莫納可林K的產量增加了135%，原因是亞油酸通過cAMP-PKA信號通路上調mokA和mokH的基因轉錄水平，而mokA是莫納可林K合成途徑中聚酮化合物合成關鍵酶PKS酶的編碼基因，mokH是與紅曲菌次級代謝相關的Zn(II)2Cys6結合蛋白的編碼基因，亞油酸使得mokA和mokH的表達更加活躍從而增加了紅曲菌次級代謝產物莫納可林K的產量。ZHANG等[36]研究了谷氨酸對紅曲菌莫納可林K生物合成基因簇表達的影響，結果表明與原始培養基相比紅曲菌在谷氨酸培養基中莫納可林K的產量增加了3.5倍，通過電鏡觀察分析，谷氨酸使紅曲菌的菌絲體顯著增加，改變了紅曲菌菌絲的滲透性，從而增強了莫納可林K向細胞外的分泌。另一方面，谷氨酸還上調了莫納可林K合成途徑中mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH和mokI的表達水平，而且谷氨酸還可以產生莫納可林K合成的底物乙酰輔酶A，以上多方面原因使紅曲菌莫納可林K的產量得以提高。紅曲菌莫納可林K合成途徑中相關基因、基因簇的研究起步較晚，許多研究尚未透徹，但上述研究為從分子水平上控制紅曲菌莫納可林K的代謝合成提供了新思路，應作為今后莫納可林K控制策略研究的重點領域。

4 展望

目前，《中國藥典》2015年版已經對功能性紅曲中莫納可林K的含量與測定方法做出了明確規定[37]，且歐美許多國家對于功能性紅曲產品進口質量和需求越來越大，檢測方法也越來越嚴格[38]，這使得我國功能性紅曲產業面臨著新的挑戰。

國內外科研人員已經從菌種選育、培養基優化、環境因子控制和代謝途徑控制等方面研究提高紅曲菌及其發酵產品中莫納可林K的含量。今后對于莫納可林K的控制一方面應該運用分子生物學方法研究分析出紅曲菌莫納可林K合成和降解的相關基因與途徑，通過促進合成或阻斷降解提高莫納可林K的產量；另一方面現階段國內功能性紅曲工廠的生產工藝大多還處于塑料瓶發酵階段，發酵周期長、產量低、人工成本高等問題制約著我國功能性紅曲產業的發展，許多研究成果由于操作困難、環境限制或成本昂貴難以實現產業化，因此除了要繼續深入對紅曲莫納可林K產量控制的研究以外，對于功能性紅曲發酵設備的研究已刻不容緩，只有實現了功能性紅曲產業的機械化、自動化，才能更好地將紅曲莫納可林K產量控制策略的研究成果應用到實際生產中。