微生物酯酶的開發及其在食品工業中的應用現狀

畢文慧，桂倫，姚健*

1(山東農業工程學院 食品科學與工程學院，山東 濟南，250100)2(江西省農業科學院 農業應用微生物研究所，江西 南昌，330200)

酯酶(estersae)是一種能夠催化酯鍵斷裂和形成，參與轉酯、酯化和酯交換反應的水解酶。廣義上講，羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)、芳基酯酶(arylesterase，EC3.1.1.2)、脂肪酶(triacylglycerol lipase，EC 3.1.1.3)、丹寧酸酶(tannase，EC3.1.1.20)等統稱為酯酶[1-2]。酯酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，其中大部分工業酯酶都來源于微生物，如細菌的芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderiasp.)、低溫桿菌屬(Psychrobactersp.)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和不動桿菌屬(Acinetobactersp.)；真菌的根霉菌屬(Rhizopussp.)、青霉菌屬(Penicilliumsp.)、曲霉菌屬(Aspergillussp.)；酵母的假絲酵母(Candidasp.)、畢赤酵母(Pichiasp.)、紅酵母(Rhodotorulasp.)和釀酒酵母(Saccharomycopissp.)均為工業生產中重要的產酯酶微生物[3-4]。微生物酯酶作為生物催化劑具有來源廣、種類多、效率高、反應條件溫和、不需添加輔酶和副產物少等優點，因此在食品工業領域應用廣泛[2]。

1 微生物酯酶的研究進展

1.1 新型酯酶的開發

根據酯酶最適反應溫度可分為高溫酯酶、中溫酯酶和低溫酯酶。中溫酯酶(Mesophilic esterase)是目前開發和應用最多的一類酯酶，其在常溫下具有較高催化效率，但在高溫、低溫環境下易失活。由于中溫酯酶對熱、冷、有機溶劑和高鹽環境抗性較差，限制了其在一些存在極端溫度、化學試劑條件下的工業生產中使用。

高溫酯酶(Thermophilic esterase)在高熱環境中有著特殊的穩定性和催化能力，海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)TM1160酯酶在90 ℃下作用1 h后仍可保留50%酶活性[5]，而嗜熱泉生古細菌K1(AeropyrumpernixK1)酯酶則可將作用時間延長到160 h[6]。此外，許多高溫酯酶對有機溶劑、重金屬、鹽等化學試劑有較高的耐受性。如TM1160 酯酶可在甲醇、DMSO等有機試劑中常溫處理12 h后仍保持活性[5]；分離自紅海宏基因組文庫的EstATII酯酶可在4.5 mol/L鹽溶液中保持活性，在鈣、鎂、鐵等金屬離子存在時至少可以保持60%酶活性[7]。大多數酯酶底物特異性較低，可催化不同結構酯類的水解，但來源于海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的高溫酯酶TM0077卻具有極高的底物特異性，這一發現有利于提高酯解反應的專一性、降低副產物[8]。高溫酯酶的上述特性有利于降低對生產中冷卻系統的需求，減少雜菌污染，提高產物純度，非常適用于食品熱加工行業。

低溫酯酶(Psychrophilic esterase)在低溫或常溫條件下均具有較高催化效率，但在高溫條件下會快速失活。研究人員從海洋、冰川和沼澤等低溫環境中分離到了一些性能優良的低溫酯酶。這些低溫酯酶最適溫度一般在40 ℃左右，并能在較長時間低溫處理后保留較高酶活性。如海旋菌(Thalassospirasp.)GB04J01.的酯酶ThaEst2349最適作用溫度為45 ℃，且在10 ℃和20 ℃下孵化2 h后仍具有85%和90%的酶活性[9]；腸桿菌(Enterobactersp.)酯酶EstA最適作用溫度為40 ℃，在0 ℃下可保留75%的酶活性[4]；冰川鞘氨醇單胞菌(Sphingomonasglacialis)PAMC 26605的羧酸酯酶EstSP2最適作用溫度為40 ℃，在4～25 ℃活性保持穩定，并且在濃度為40%的二甲基亞砜、甲醇、乙醇溶液中仍可保留75%酶活性[10]。此外一些具有特殊抗性的極端低溫酯酶也不斷被發現，來源于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的酯酶lp_3505最適作用溫度為5 ℃，在20 ℃下保存20 h后仍保留60%酶活性，并可耐受20%的高濃度鹽溶液[11]。低溫酯酶可用于低溫加工環境，有利于防止產物分解和熱變性；反應活化能較低，可以節約能源，在熱敏性食品生產中極具應用潛力。

1.2 宏組學技術在酯酶開發中的應用

新型酯酶的不斷發現與酯酶開發技術的進步密切相關。傳統開發采用分離培養技術，但近年來利用傳統技術獲得新活性物質越來越困難，宏基因組學技術的出現則為酯酶的開發提供了新思路。宏基因組學(Metagenome)是指以特定環境中提取的全部微生物基因組DNA為研究對象，不需要對微生物進行分離純化培養，通過構建宏基因組文庫并運用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得有用的活性物質[12]。目前通過構建土壤、海洋沉積物、活性淤泥、堆肥、溫泉等宏基因組文庫，已成功篩選到許多新型酯酶。GU等[13]提取了栗樹林土壤的總DNA，總DNA經純化后與pWEB-TNC載體連接并轉化到EscherichiacoliEPI100-T1R中，構建了土壤宏基因組文庫。之后利用含三丁酸甘油酯的LB平板從文庫中篩選到新型酯酶EstGX1和EstGX2，兩者為微生物脂類水解酶第IV家族的新成員，對兩種酯酶進行特性研究發現EstGX2具有較高熱穩定性，在99 ℃下處理55 min后仍能保持40%活性，并且具有獨特的嗜堿性，最適pH為9.0。同樣利用宏基因組技術，LEE等[14]構建了豬糞-蘑菇廢棄物堆肥宏基因組文庫并分離到新型酯酶est7K，對該酶酶學特性研究發現其最適反應條件為40 ℃和pH 10.0，并且在30%甲醇存在時其活性可提高2.1倍；RANJAN等[15]在海洋沉積物宏基因組文庫和溫泉宏基因組文庫中共挖掘到10種酯酶基因，這些功能基因在序列結構、催化功能上有其獨特之處，并且部分酯酶基因來源于未知微生物。宏基因組學從大量不可培養微生物中發現了許多催化特性、耐受性獨特的新型酯酶，極大地豐富了酯酶種類。

除了發現在工業生產中有潛在用途的酯酶以外，宏基因組文庫功能篩選研究還發現了一些新的酶學特性信息，在牛瘤胃細菌宏基因組文庫中識別到一種新型酯酶Est5S，其與任何已知脂肪水解酶均沒有顯著的序列相似性，被歸類為酯酶新家族——第XV家族[16]；在一個曬鹽場土壤宏基因組文庫中篩選到的一種屬于第IV家族(HSL)的新型酯酶EstSP，但該酶具有獨特的GDSGG保守區域，這有別于之前在HSL酯酶家族中所發現的GDSAG和GTSAG保守區域[17]。

宏基因組學研究針對全部基因組序列，但是在基因組中存在大量非編碼序列，這些序列的存在干擾了功能序列的研究，使宏基因組學僅適用于基因組較小的原核生物中。宏轉錄組學(Metatranscriptomics)是在宏基因組學基礎上發展起來的一項新技術，其以特定環境、特定時期所有生物轉錄的全部RNA為研究對象。該技術可以直接通過微生物mRNA反轉錄獲得cDNA，避免了真核微生物基因組中內含子的影響，將基因篩選范圍從原核微生物擴展到了真核微生物[18]。KELLNER等[19]提取、純化了森林土壤的總RNA，并以其為模板合成cDNA，經SfiI酶切后的cDNA片段與pTEF-MF酵母表達載體相連接，再轉化到大腸桿菌中，構建了宏轉錄組文庫；并利用Saccharomycescerevisiae磷酸酶突變體從文庫中篩選到了新型酸性磷酸酯酶。TAKASAKI等[20]采用類似方法構建了森林土壤宏轉錄組文庫，通過序列和功能篩選相結合的方法從中獲得129個糖水解酶類序列，并且這些序列大多來源于真核微生物。隨著RNA提取、純化技術的不斷進步，宏轉錄組技術在新酶開發中的應用也將越加深入。

2 酯酶在食品工業中的應用研究

2.1 酯酶在食品加工中的應用

2.1.1 乳制品加工中的應用

酯酶在乳制品增香、脫脂或奶味香精加工方面極具應用潛力，在加工中使用可改善產品的口感、風味和品質。酸熱脂環酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的高溫酯酶EST2能高效合成短鏈脂肪酸，將其用于干酪加工可合成風味物質己酸乙酯，而未添加EST2酯酶的對照組中則未檢測到該成分[21]；脂肪酶同樣可以通過水解牛奶中的短鏈脂肪丁酸和己酸生成芳香成分，提高牛奶感官品質[22]。此外，乳制品經酯酶水解處理后可制得富含中、短碳鏈脂肪酸，奶油香氣自然、柔和，風味接近于奶酪的天然奶味香精。Novozyme Palatase 20000L、Lipozyme-435、Novozyme-435等脂肪酶通過水解牛奶或稀奶油，均可制得奶香濃郁、純正的酶解產物[23-24]。

但以單一酯酶催化制備奶味香精，其產物成分分布較窄、風味單調、易存在不良后味，難以獲得高品質的產品。為進一步提高奶味香精品質，研究人員嘗試將多種酯酶復合用于奶味香精制備。以Palatase 20000L和Lipase MER組成的復合酶體系酶解處理黃油制得的酶解產物含有中、短鏈脂肪酸、酮類、酯類等11種成分，具有純正的奶油香氣，且口感更加飽滿、風味濃郁、無不良后味[25]；先以脂肪酶A12和脂肪酶MER復合處理黃油，再加入蛋白酶酶解后制得天然奶酪味香基，具有典型奶酪香氣，并且味道厚重、柔和，留香時間更長[26]。

上述商業化酯酶作用溫度一般在45～80 ℃之間，較高的溫度易導致乳制品水解產生的熱敏性香味成分在加工過程中揮發或氧化變性，影響產品風味。解決上述問題最直接的方法就是降低生產溫度，因此研究人員嘗試將低溫酯酶用于乳品加工。以酯酶restTB11在25 ℃下酶解處理稀奶油，所得酶解產物相較Palatase 20 000L產物，風味化合物種類更豐富，相對含量更高，酸味較少，奶香更加濃郁[3]，由此證明低溫酯酶是乳制品加工行業的潛力工業酶。

2.1.2 油脂加工中的應用

油脂是食物的重要組成成分，油脂中脂肪酸主鏈的長度、飽和度、支鏈數及脂肪酸的位置決定著油脂的營養價值、感官價值、商品價值。酯酶可通過改變脂肪酸鏈中甘油醛的位置，實現油脂的增值加工。代可可脂作為可可脂替代品工業需求量大，具有較高商品價值。其可通過一種或多種低價油脂經酯交換反應制得，如以價格低廉的棕櫚油中間分提物為原料，經LipozymeTM酶催化可制備代可可脂[27]；而以棕櫚油中間分提物與菜籽油混合物為原料，經Lipozyme RM IM脂肪酶催化制備的代可可脂中富含omega-3和omega-6，特性與可可脂相近[28]。

以酯酶處理肉制品可以催化肉類中脂肪水解，實現肉制品降脂、脫脂，從而降低心血管疾病、糖尿病的致病風險。來源于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的脂肪酶可在72 h內將雞肉脂肪降解為短鏈醛類或酮類物質，從而降低肉制品中脂肪含量[29]。酯酶處理肉制品還可以提高產品感官品質，以1.50%用量Yiming脂肪酶在50 ℃、pH 8下水解處理濃度為55%的豬油2.5 h，1.25%用量Novozymes脂肪酶在55 ℃、pH 8下水解處理濃度為55%的豬油4.0 h，1.00%用量Amano脂肪酶在pH 6、45 ℃下水解處理濃度為50%的豬油2.5 h，所得水解產物中游離脂肪酸含量較對照組分別高出89.40%、85.80%和89.92%。油酸、反油酸、十七碳烯酸等多種脂肪酸為豬肉揮發性芳香物質的前體，大量脂肪酸的產生有助于增加豬肉的特征性香味及促進香氣的釋放[30]。

酯酶在油脂工業中的另一重要用途是水解油脂制備游離脂肪酸，如米根霉(Rhizopusoryzae)中的rProROL脂肪酶可水解大豆油獲得甘油二酯[31]。但單一酶水解油脂效率普遍低于復合酶，Novozym 435、Lipozyme TL-IM和Lipozyme RM-IM等單一商品酶對大豆油水解率均低于50%，但將80% Lipozyme RM-IM與20% Novozym 435配合使用水解率可達 80%以上[32]；對來源于黑曲霉的4種脂肪酶的活性研究也同樣證實復合酶對大豆油的水解率更高[33]。

2.1.3 酒類生產中的應用

酯類物質是酒中的主要芳香組分，其產生與酯酶的釋放有關，酯酶能促進酯類合成，調控酯類和游離酸之間的平衡，影響酒的特征香氣。傳統生產中酯類物質合成反應過程非常緩慢，需要長期窖藏才能完成。為快速提升酒中酯類物質含量，生產廠家常以富含酯類物質的酯化液勾兌酒液或在發酵過程中添加酯酶制劑或產酯酶微生物[34]。

濃香型白酒可以利用酯化液進行勾兌來提高酒體中總酯含量，增加酒香和風味。酯化液是通過酯化反應將有機酸、醇等成分轉化為類似白酒香味成分的混合液。以己酸和乙醇混合液為原料，添加脂肪酶僅經過7 d的反應即可獲得富含己酸乙酯的酯化液，大大縮短了酯類物質合成時間[35]。更加經濟的方式是以產酯酶紅曲霉處理白酒釀造中的副產物生產酯化液。釀酒尾水是白酒液態發酵主要副產物，將其與乙醇、己酸混合，經紅曲霉發酵可制得總酯含量137.01 mg/100 mL，其中己酸乙酯含量222.71 mg/L，乳酸乙酯含量74.61 mg/L的酯化液[36]。黃水是白酒固態發酵的主要副產物，以其為原料添加紅曲發酵，在最佳條件下總酯的含量為0.63 g/100 mL，其中己酸乙酯和乳酸乙酯的相對百分含量最高可達42.70%[37]。以上述酯化液進行濃香型白酒的勾兌，可達到提高酒質和生產效率的雙重目的。

酒類生產中所用酶制劑主要包括脂肪酶、磷酸酯酶、酯合成酶、酯分解酶等。傳統生產中的酯酶均由釀造微生物分泌產生，在葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵時期，釀酒酵母及乳酸菌所產酯化酶能夠提高或降低酒中各種酯類物質的含量，對酒香的形成具有重要意義[38]。在現代生產中可通過添加酯化酶制劑或分離純化產酯化酶微生物來提高其含量。紅曲霉酯化酶制劑可提升濃香型白酒中己酸乙酯含量，提高己酸乙酯與乳酸乙酯比例[39]；來源于酒類酒球菌(Oenococcusoeni)的酯酶EstA7可將葡萄酒中乙酸己酯的含量提高22.7%[38]。篩選自青酒大曲的紫色紅曲霉FBKL3.0018具有較強酯化能力，以其生產的高酯化大曲用于濃香型白酒的生產可減少用曲量，加快酒醅酯化速度，提高成酒中總酸、總酯含量，出酒率及優質品率分別提高了0.7%和10.8%[40]。一株從海泥中篩選到的產酯酶枯草芽孢桿菌，將其粗酶制劑用于無窖泥釀造濃香型白酒，成酒中己酸乙酯可達2 236.13 mg/L[41]。

2.2 酯酶在食品農殘檢測中的應用

除了在食品加工領域的應用，酯酶還可用于食品安全監測。在農產品生產過程中通常會施用農藥，大多數農藥難以完全降解會直接或間接地殘留于農產品中，通過生物鏈的富集最終進入人體，對人體健康造成損害。其中有機磷農藥作為使用最廣泛、毒性最強的農藥，極大影響了食用農產品的安全性[42]。目前，氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、超臨界流體色譜法(SFC)、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)等都可對農藥殘留進行高靈敏度和高精確度的檢測，但由于所用儀器設備昂貴、耗時較長和專業性強等因素難以實現農產品原位實時快速檢測。

近年來，生物傳感器快速檢測技術因易操作、成本低、能快速原位檢測而被廣泛研究及應用于食品(農產品)農殘檢測中。目前發展最為成熟的生物傳感器是以乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)構建的電流型生物傳感器。AChE能催化底物乙酰膽堿水解產生膽堿和乙酸等具有電活性的物質，而有機磷農藥可以抑制乙酰膽堿酯酶的催化活性，降低電活性的物質量，使電流檢測信號減弱。利用這一反應，可以建立酶活性抑制率與有機磷農藥的線性關系，從而定量檢測食品中農殘含量[43]。目前所構建的乙酰膽堿酯酶生物傳感器已在多種食品農殘檢測中成功應用，以Pt/ZnO/AChE為電極的生物傳感器檢測到蘋果中克菌丹殘留量，檢測范圍在0.05～25.0 μmol/L，檢測限為107 nmol/L，重復率可達98.4%～102.4%[44]；改進后的Pt/ZnO/AChE/殼聚糖生物傳感器檢測到了大米中丁硫克百威殘留量，并將檢測靈敏度降低到納米級別，檢測范圍在5～30 nmol/L，檢測限為 0.24 nmol/L，重復率為99.06%～100.96%[45]。利用構建的玻璃碳/石墨烯/AChE生物傳感器對西紅柿樣品中的胺甲萘殘留進行定量檢測，檢測值為(0.47±0.04)μmol/L[46]，AChE生物傳感器對農藥殘留普遍具有較高的檢測靈敏度。以上生物傳感器是基于對AChE的抑制作用而實現對農藥殘留量的檢測，但AChE蛋白質的低穩定性及對金屬、有機溶劑的敏感性導致其使用受到限制。為提高生物感應器穩定性，JANIS等[47]以具有高穩定性可適應不同pH值和溫度、對低濃度有機溶劑和洗滌劑具有耐受性的羧酸酯酶EST2構建生物傳感器，并將其用于果汁、酒及水中農殘的定性、定量檢測，質譜檢測證實該生物傳感器檢測結果可靠。

3 展望

對酯酶的研究一直是生物催化領域的重點，新型酯酶或酯酶家族不斷地被發現，但是目前真正投入工業化應用的酯酶種類較少，且以中溫性酯酶為主。許多具有獨特催化特性，溫度、有機溶劑、高鹽環境耐受性的高溫和低溫酯酶由于產量低、成本高、酶學特性不能完全滿足工業生產需求，未成功應用于工業生產中。從自然環境中挖掘適用于工業生產的新型酯酶，豐富酯酶資源及酶學信息，擴展其在食品工業領域應用仍是將來的研究重點。