培養液成份變化對胚胎發育的影響

張寧媛，孫海翔

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學科，南京 210008)

胚胎體外培養的目的是保持胚胎的發育質量，增加成功分娩健康嬰兒的機會。培養液是胚胎體外發育的能量補給站，培養液成份的改進，維持甚至改善了胚胎在體外培養期間的發育潛能。胚胎體外培養的主要目標是盡可能滿足植入前胚胎發育的要求。胚胎在體外條件下，需要不斷適應微環境的變化。在有效培養系統下，小鼠胚胎在體外獲得了與體內相似的發育速度與質量[1]。現有商品化培養液，能保持胚胎較好的體外發育能力。本文闡述了胚胎培養液的設計策略、培養液的能量代謝與pH緩沖的需求及研究結果，以期優化培養液使用策略，促進胚胎發育。

一、培養液設計策略

卵裂期胚胎通常在輸卵管中發育至囊胚后進入子宮腔。在人類子宮中，胚胎發育的主要能量物質(丙酮酸、乳酸或葡萄糖)的濃度，在整個月經周期中幾乎沒有變化。子宮液中的丙酮酸濃度(0.1 mmol/L)明顯低于卵泡期和月經中期輸卵管液中的丙酮酸濃度(0.25 mmol/L和0.32 mmol/L)。子宮液中乳酸水平(5.87 mmol/L)也低于月經中期輸卵管中的乳酸水平(10.50 mmol/L)。相反，子宮液中的葡萄糖濃度(3.15 mmol/L)明顯高于輸卵管中的葡萄糖濃度(0.50 mmol/L)[2]。這些觀察結果表明，胚胎從處于母體遺傳控制之下偏好丙酮酸，到胚胎基因組激活后轉移到葡萄糖代謝。囊胚期胚胎表現出更高的代謝需求。

依據著床前胚胎在不同發育階段對培養條件的特定需要，基于“回歸自然”的理念，設計出序貫培養液[3]。各種商品化的人類胚胎序貫培養液，都試圖模擬發育中的胚胎不斷變化的需要，盡可能接近自然環境。胚胎體外操作過程引起的細胞和代謝的應激，胚胎被迫需要消耗能量來應對這樣的外來環境變化；同時人們對輸卵管和子宮環境的認識進一步加深，也促進了培養液成份的不斷改進。

輸卵管對配子、受精和早期胚胎發育具有特異性和顯著性的影響。早期宮腔環境對胚胎發育也十分重要。人子宮液中氨基酸濃度為3.54 mmol/L。宮腔中檢測到的18種氨基酸的相對濃度不受年齡、體重指數、周期或特定良性婦科疾病的影響，但飲食習慣會影響氨基酸的相對濃度，健康飲食與非健康飲食的婦女的子宮液中，天冬酰胺、組氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸濃度存在差異[4]。

在動物胚胎體外培養過程中，為了盡可能接近生理條件下的培養環境，在培養液中添加生殖道液體。實驗結果顯示，精子上游液體中添加生殖道液體后，提高了豬卵的受精率；胚胎培養液中添加了生殖道液體后，提高了豬的囊胚質量，囊胚的細胞數量增加、更易孵化。同時，培養過程添加了生殖道液體的胚胎，參與重編程、印跡和發育的基因受體外培養的影響較少，更接近體內發育的胚胎[5]。

單一培養液不同于序貫培養液，將同一成份培養液覆蓋了從受精到囊胚的整個著床前胚胎的全程體外培養過程。其設計思路是“讓胚胎選擇”，即在培養液中，包括了所有濃度的混合物，而胚胎本身會適應和利用它所需要的一切營養和能量，主動控制離子梯度等，并能調節其內部環境。已有文獻數據顯示，人類胚胎可以在單一培養液中連續培養至囊胚期，而不需要在48 h換液。單一培養液培養為胚胎提供了更穩定的培養條件，胚胎的形態動力學參數也未受影響，可產生更多的優質胚胎[6-8]。

二、培養液的能量代謝

細胞的新陳代謝具有兩種功能：一是提供細胞維持細胞內穩態所需的能量，二是提供用于細胞生物合成的物質。體外胚胎發育至囊胚的過程中，胚胎的能量代謝存在發育階段的特異性[9]。

總體上說，胚胎著床前，添加到胚胎培養液中的主要能量基質有丙酮酸、乳酸和葡萄糖。早期階段，ATP(adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)的代謝相對較低，ATP/ADP(adenosine diphosphate，二磷酸腺苷)比值較高，能量代謝的特點是消耗好氧底物，如丙酮酸、乳酸和谷氨酰胺，葡萄糖利用少。桑椹胚階段，代謝活動開始急劇上升，ATP/ADP比值下降，對能量的需求增加。細胞分裂的數量增加，蛋白質的生物合成和與囊胚腔形成相關的離子泵作用，成為能量的主要消耗過程。早期的首選營養物質丙酮酸鹽的吸收水平下降到非常低的水平，而葡萄糖的吸收水平上升。

具體情況是，在卵丘-卵母細胞復合體中，卵母細胞強調糖酵解和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway，PPP)途徑[10]。糖酵解通過己糖激酶的活性提供重要的能量來源。PPP為嘌呤的合成提供原料。己糖胺生物合成途徑對于卵丘細胞的細胞外基質擴張十分重要。多羥基化合物途徑提供山梨醇和果糖作為其他能量來源，維持氧化還原平衡。卵母細胞和卵丘細胞之間的代謝也存在相互的作用。與卵丘細胞相比，卵母細胞缺乏糖酵解高效代謝葡萄糖、從醋酸酯合成膽固醇和直接攝取丙氨酸的能力。相反，卵母細胞從卵丘細胞中獲得糖酵解(如丙酮酸)和膽固醇生物合成(如膽固醇)途徑的產物以及丙氨酸。同時，卵母細胞分泌旁分泌因子來促進這一過程。受精后，受精卵以丙酮酸、乳酸等三羧酸為主要能量來源[11]。卵裂期胚胎的代謝以丙酮酸、乳酸代謝為主、并以低水平氧化特定氨基酸為基礎。胚胎的代謝模式最初以丙酮酸為能量來源。當胚胎發育到桑椹胚期以后，葡萄糖的消耗量急劇增加，從低糖利用轉化為高糖利用。小鼠囊胚中內細胞團(inner cell mass，ICM)幾乎完全采用糖酵解方式，滋養細胞(Trophectoderm，TE)則消耗一半葡萄糖轉化為乳酸。葡萄糖需求的增加，為囊腔的形成和維持提供了能量來源。囊胚腔的乳酸濃度比周圍環境更高。谷氨酰胺和脂質可分別通過三羧酸循環或脂肪酸氧化，作為著床前胚胎發育各階段的能量來源。脂質代謝在8細胞期之前保持相對穩定，但在8細胞期和桑椹胚期之間突然增加。胚胎的平均耗氧量在第一次分裂時達到峰值，胚胎致密化后耗氧量下降到最低，然后逐漸增加到囊胚期[12]。囊胚中兩種細胞ICM和TE的代謝也有差異[13]。與TE相比，ICM細胞的代謝相對安靜。而TE比ICM包含更多的線粒體，比ICM消耗更多的氧，也產生更多的ATP。與ICM相比，TE產生囊胚中大約80%的ATP。TE產生能量的主要來源可能是位于TE基底外側膜上的Na+、K+ATPase(鈉泵酶)。

囊胚培養液中存在過量的乳酸鹽可能是造成胚胎應激的一個因素。在對107名23～40歲之間的患者進行的一項前瞻性同卵比對試驗中，比較了使用低乳酸水平或高6倍乳酸水平的培養液，發現在低乳酸培養液中培養的胚胎，妊娠和持續妊娠的比例更高，提示低乳酸培養液促進人胚胎的體外發育[14]。兩個獨立的體外受精實驗室分別使用序貫培養液(G-Series)或單一培養液(CSCM-NX)、單一培養液(CSCM)或單一培養液(CSCM-NX)，培養胚胎至囊胚期，檢測胚胎的非整倍體率，得出了一致的結論。由于CSCM-NX的乳酸濃度較低，通過簡單地改變培養液乳酸濃度，使用低乳酸濃度的單一培養液(CSCM-NX)培養的胚胎，整倍體胚胎數量增加了約10%[15]。這提示了培養液中過量的乳酸鹽，可能通過影響細胞的紡錘體組裝和染色體分離，改變胚胎發育和細胞完整性，增加有絲分裂過程中非整倍體的發生。

三、培養液的pH緩沖

體外胚胎培養需要細胞內穩態，維持胞內pH(pHi)，調節細胞發育。動物實驗中，胚胎培養液中添加弱酸DMO(5，5-二甲基-2，4-惡唑烷二酮)，結果顯示：無論是在受精卵向2細胞或者2細胞向8細胞分裂期間短時間添加，還是從受精卵持續到囊胚期的長時間添加，盡管囊胚發育和形態沒有改變，但均出現囊胚質量下降，細胞數量減少而凋亡增加。第一次卵裂期間添加DMO，不改變種植結局，但胎鼠體重、冠臀長均明顯下降；而如果在整個著床前發育過程中持續暴露于DMO中，不但降低胚胎著床率，而且降低胎鼠體重和冠臀長度。由此可見，細胞內pH值的輕微變化，可以顯著影響胚胎發育和生存能力，提示著床前小鼠胚胎對細胞內pH高度敏感[16]。適當而穩定的培養液pH值，對維持胚胎持續發育的能力顯得至關重要。

pH值的平衡取決于化合物的結合或離解。維持細胞內穩態，最重要的離子是鈉、鉀、鎂、氯和乳酸。在人類卵裂期胚胎中，細胞內pH值為7.2。培養液的pH值主要通過培養箱提供的CO2濃度的平衡和培養液中碳酸氫鹽的濃度來調節[17]。升高CO2會降低培養基的pH值，反之則提高pH值。平衡的時間取決于CO2在介質中的擴散和反應的時間[18]。介質的體積、表面積、油層的使用等，都會影響氣體交換和平衡的時間。即使提供相同的CO2濃度、相同的基礎培養液，在不同的實驗室之間可能會產生不同的平衡時間。

在培養液中使用緩沖液有助于穩定pH。不同的緩沖介質，緩沖能力是有差異的。監測碳酸氫鹽和HEPES兩種緩沖介質的培養液的實時pH值時，可以發現，大氣環境下3 min后，碳酸氫鹽緩沖介質的pH已經超過7.4，而HEPES緩沖介質在7.3左右可以穩定10 min以上。與單獨添加NaHCO3比較，兩性離子緩沖顯著增加了緩沖能力[19]。最常用的緩沖液HEPES和MOPS，兩者的pKa值都是7.2，是兩性離子緩沖液中最接近于胚胎pH值的。其中MOPS在酸性范圍內的pH緩沖稍好，而HEPES在堿性范圍內的pH緩沖稍好。將這兩種廣泛使用的緩沖液以1∶1的比例(每一種10 mmol/L)結合起來使用，比相同濃度的單個緩沖液，增加了有效緩沖能力。與單獨使用20 mmol/L的MOPS或HEPES相比，將兩種緩沖液以1∶1的比例組合使用，緩沖范圍相似，允許pH在MOPS或HEPES之間緩沖。雙緩沖介質(MOPS+HEPES)的培養液，有助于增強體外精子的存活能力。比較8 h與48 h兩個時間點，雙緩沖介質與單緩沖介質培養液中的精子參數，發現雙緩沖介質中的精子活力更好、前向運動精子的比例更多[20]。為了降低對胚胎的應激以及可能的毒性反應，只要維持適當的pH穩定和支持胚胎發育，應盡可能減少緩沖介質的濃度。

四、小結

胚胎培養液的總體設計策略，應該是在胚胎體外發育時，通過提供底物，來引導胚胎采用相應的代謝模式，利用內源性營養物質。培養液是配子與后續胚胎體外發育相互作用的重要因素。作為人類胚胎生長的外部環境，培養液的設計是復雜的，需要選擇合適和必要的成分，盡量減少對胚胎的應激。