間充質干細胞應用于卵巢儲備功能減退治療的研究進展

曹孟，蔣春艷，崔毓桂，覃蓮菊

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心，南京 210029)

卵巢內卵母細胞的數量(即卵巢儲備)反映卵巢生殖功能狀態。卵巢儲備功能減退(Diminished ovarian reserve，DOR)是指女性卵巢內剩余的卵母細胞數量較少或質量較低而導致生殖能力衰減的一種病理癥狀，在女性不孕因素中約占10%。DOR患者仍維持正常的月經周期，但卵巢對促排卵藥物反應低，助孕結局相對差。目前DOR的發病機制尚不明確，病因復雜，主要有年齡因素、遺傳因素(如脆性x綜合征)、自身免疫性疾病(如腎上腺損傷)、醫源性因素(放療、化療或手術)等。目前DOR臨床治療方法包括人工輔助生殖技術(ART)、激素替代療法(HRT)、卵巢移植、線粒體移植等。但是，因DOR患者卵巢反應低，ART成功率并不高；HRT僅能改善患者部分臨床癥狀，并不能從根本上改善DOR患者的卵巢功能和生殖能力，且有增加患者血栓性疾病、卵巢腫瘤及乳腺癌的風險；贈卵尚存在醫學倫理問題；而卵巢移植、線粒體移植尚需突破技術瓶頸。因此，臨床迫切需要探討有效的DOR治療新方案以提高DOR患者的生殖能力，提高其ART助孕的活產率。

干細胞具有多向分化潛能，在誘導條件下能分化為特定類型的各類組織細胞[1]，在再生醫學領域具有重要應用前景。其中，間充質干細胞(MSCs)來源充足、免疫原性低，同時可避免倫理問題，國內外已應用于多項組織修復/再生醫學的臨床研究[2]。近年研究顯示，不同來源的MSCs均可改善小鼠受損的或者自然衰老的卵巢功能及卵巢儲備[3-4]，提示MSCs治療有望成為提高DOR患者生殖能力的新型療法。本文綜述MSCs特性及其治療DOR的基礎與臨床研究進展。

一、MSCs特征

1968年Friedenstein等首先發現并分離了成人骨髓MSCs(BMMSCs)，之后研究者陸續從許多成體組織中分離到相應的MSCs[5]，表明MSCs易于分離、體外增殖，免疫原性低，且具有遺傳穩定性[6]。2006年，國際細胞治療協會的間充質干細胞和組織干細胞委員會明確了人類MSCs的基本識別特征[7]：(1)在標準培養條件下，MSCs可在塑料培養板上貼壁生長；(2)體外高水平表達CD105、CD73和CD90，不表達或極低水平表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19及HLA-DR；(3)具有體外分化為成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞的能力。

MSCs具有免疫調節及抗炎、抗凋亡、促傷口愈合及組織修復等功能[8]。MSCs移植到體內后，能遷移到受損組織(也稱歸巢)并分化成組織特異性細胞從而達到修復的目的[9]，或驅動由內源性細胞觸發的修復[10-11]。早在2008年，Yoshikawa等[12]的一項臨床研究，利用含自體BMSCs的移植物治療了18例患者不同原因的不愈合創面，所有受試者的皮膚創面均獲得了完全的再上皮化。Xu等[13]報道一項小樣本的瘢痕子宮MSCs治療的臨床研究，將附著人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)的可降解智能生物材料置入患者的瘢痕子宮，發現hUCMSCs促進了瘢痕處內膜、肌層及血管的再生；同時發現，經 hUCMSCs治療后子宮瘢痕得到功能性恢復，甚至可正常妊娠。目前，許多研究關注于MSCs在細胞療法中的應用。MSCs被用作治療關節退行性變化和重建骨骼和軟骨的工具，用于整形手術、美容醫學、心血管疾病、內分泌和神經系統疾病，以及修復受損的肌肉骨骼組織[14]。最近，脂肪來源的干細胞產品已被歐洲藥品管理局注冊用于治療復雜的肛周瘺[15]。之前一個加拿大的研究小組分析了使用人骨髓間充質干細胞(hBMMSCs)的臨床試驗，在對36項研究進行徹底分析后，他們發現MSCs的使用與致瘤潛力之間沒有關系，印證了臨床應用的安全性[16]。越來越多的臨床研究均表明MSCs在明顯改善治療結局的同時并沒有報道嚴重的毒副作用[17-19]。

二、 MSCs在DOR動物模型的應用研究

近年較多實驗研究，探討MSCs修復卵巢儲備功能。Asif等[20]采用連續15 d(50 mg/kg/d)腹腔注射CTX的方法化療構建卵巢功能早衰(Premature ovarian failure，POF)的小鼠模型，將1×106個hUCMSCs通過靜脈注射移植至POF小鼠體內，一周后卵巢獲卵數(108±15)個，而對照組POF模型小鼠的獲卵數為(39±13)個(P<0.01)，hUCMSCs治療組血清E2水平也明顯高于對照組(P<0.05)；卵丘細胞凋亡減少，卵巢儲備功能明顯改善。Mohamed等[21]則用70 mg/kg/d CTX靜脈注射小鼠1周造模，將5×105個hBMMSCs局部注射至模型小鼠雙側卵巢中，分別在注射后的第2、4、6、8周從體重、激素水平、卵泡儲備水平進行評估，結果發現2周時即觀察到hBMMSCs治療組總體重、卵巢重量的增加，并持續到實驗結束；治療組平均卵泡數明顯高于對照組，血清 FSH水平較低(P=0.03)，抗苗勒氏管激素(AMH)水平則較高(P=0.005)，提示hBMMSCs恢復化療藥物損傷卵巢的小鼠的激素水平、重新激活了小鼠的卵泡發育。其他一些研究表明，月經血、羊膜、羊水、脂肪等多種來源的MSCs在移植入DOR模型小鼠體內之后，均發現E2、AMH水平升高、FSH水平下降；同時卵泡數量增加、生育能力提高[22-23]。綜合起來，MSCs可明顯改善DOR模型動物的卵巢儲備能力、提高生殖能力。

三、MSCs治療DOR的臨床研究

國內外報道多項MSCs治療DOR的臨床研究。截至2019年5月1日，在國際臨床試驗登記網站(https：∥clinicaltrials.gov)注冊的MSCs治療DOR臨床研究項目共有15個：細胞類型包括自體骨髓MSCs(8項)、異體骨髓MSCs(1項)、臍帶MSCs(3項)、自體脂肪組織(1項)、自體脂肪間質細胞(1項)、人胚胎干細胞(hESCs)來源的MSCs樣細胞(1項)；給藥方式包括卵巢局部移植(11項)、靜脈移植(3項)、卵巢動脈移植(1項)；實施的國家包括中國(6項)、埃及(5項)、美國(1項)、約旦(1項)、西班牙(1項)、伊朗(1項)。

2018年的一項臨床研究，POF患者納入標準為18～39歲、閉經持續時間>1年、1～2次FSH≥40 U/L，HRT方案Premarin(0.625 mg/d，25 d)聯合Provera(10 mg/d，每月10 d)治療2年后經臨床觀察，均無成熟卵泡或未孕(排除染色體核型異常、男方因素，既往手術史或其他相關病理)，將符合條件的16名患者隨機分為兩組：一組(n=6，2例患者取消UC-MSC移植方案)接受UC-MSC移植加HRT(UC-MSC組)，另一組(n=8)接受UC-MSC聯合膠原移植加HRT(膠原/UC-MSC組)。UC-MSCs移植是將5×106個UC-MSCs在陰道超聲引導下單側卵巢局部注入。膠原/UC-MSCs組是將UC-MSCs生長于膠原蛋白支架上，然后同UC-MSCs組進行移植。結果發現，與UC-MSC組比較，膠原/UC-MSCs更有效激活POF患者卵泡生長至排卵前階段，且有助于卵巢功能的長期恢復，包括卵巢血流量、E2水平和卵泡發育[24]。

MSCs治療DOR的安全性、有效性已得到臨床初步驗證，將會開展更多和較大樣本的臨床研究。

四、MSCs改善DOR卵巢儲備的可能機制

1.旁分泌機制：MSCs可以產生大量的可溶性細胞因子、趨化因子、生長因子等[25]促進組織損傷的修復，通常被認為是MSCs參與組織損傷修復的主要機制。眾多生物活性物質協同作用形成復雜調控網絡，可調控靶細胞內多條信號通路[26]。hBMMSCs移植后可迅速遷移到組織損傷部位，通過旁分泌作用激活組織內源性的特異性干/祖細胞的增殖和分化，參與組織損傷的修復[27]。研究發現，MSCs產生眾多生物活性物質，參與免疫調節、抗纖維化、抗細胞凋亡、抗氧化和促進血管新生等進程[28]。諸多研究表明，DOR模型小鼠在靜脈輸注hBMMSCs或局部組織內輸注/埋植人經血間充質干細胞(hMBMSCs)后，表現出更快的動員和更好的歸巢，在血液及組織局部可檢測到高水平的血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)等多種與細胞生長、炎癥及免疫調節相關的細胞因子，修復組織損傷[29-30]。這些細胞因子調節受損組織的微環境，觸發血管內皮細胞增殖、遷移和侵入，生成新的血管進而改善局部缺血。歸巢的hMBMSCs或人全血來源的MSCs分泌多種抑制凋亡的因子，抑制卵巢局部的炎癥和細胞凋亡，從而改善卵巢功能[20，22]。

2.抗氧化作用：研究發現，hBMMSCs治療可顯著提高四氯化碳誘導的肝損傷模型小鼠受損肝臟組織內的SOD水平。在受損肝組織局部，hBMMSCs分泌STC-1，后者調節肝細胞線粒體呼吸鏈，促進細胞存活，減少由活性氧介導的細胞凋亡[31]。在DOR發病機制中，年齡相關的氧化應激是一個重要環節，在卵泡發育成熟過程中，細胞內ROS和抗氧化劑保持動態平衡；當這種動態平衡被破壞，發生氧化應激，從而導致顆粒細胞、卵母細胞或早期胚胎的細胞凋亡[32]。已有研究表明，hUCMSCs及其分泌細胞因子可能通過抗氧化應激機制降低DOR模型小鼠卵巢內間質細胞、顆粒細胞的凋亡，改善卵母細胞質量及其胚胎發育潛能[33]。

3.分化為組織特異細胞：早在2003年，Ortiz等發現給博來霉素誘導肺損傷的小鼠注射mBMMSCs后，mBMMSCs可以歸巢至受損的肺部，分化成上皮樣表型的細胞，并減少肺組織炎癥[34]。另有研究將綠色熒光蛋白標記的1×104個hEnSCs的局部注射至環磷酰胺誘導的POF模型小鼠雙側卵巢21 d后，采用活體成像和免疫熒光檢測技術發現，帶有綠色熒光蛋白標記的hEnSCs遷移至卵巢間質中，并且形成了有功能的類間質細胞，促進了卵巢內在生殖干細胞的更新，明顯改善模型小鼠的卵巢功能[21]。將2×106個人羊膜上皮細胞(hAECs)麻醉狀態下種植至化療藥物誘導的POF模型小鼠雙側卵巢，在7 d至2個月檢查發現，卵巢細胞形態學恢復；活體示蹤顯示，移植的hAECs存活并遷移到卵巢組織，一些hAECs分化為顆粒細胞[23]。這些研究表明，DOR和POF模型小鼠在MSCs治療后，MSCs可遷移到受損的卵巢組織，繼而在卵巢的微環境中分化形成某種(些)具有功能的實體細胞，部分替代或補償了受損細胞，維護卵泡發育成熟微環境的完整性，改善卵巢功能，促進卵巢儲備卵泡的發育。

五、總結與展望

定向誘導多能干細胞分化為卵母細胞，也可能成為臨床治療DOR的有效方案[35]，但該技術剛起步，尚需克服眾多的理論及技術障礙。鑒于MSCs來源廣泛、免疫原性低、可體外增殖，成為目前臨床細胞治療研究較多的細胞，也是有希望應用于臨床的細胞。MSCs對卵巢功能修復的效果已經凸顯，初步臨床研究的成功給DOR患者的生育帶來希望。目前迫切需要開展規范的臨床試驗和多中心合作，以明確MSCs治療DOR的適應癥、禁忌癥、給藥方式、劑量、治療周期，以及合適的細胞類型，客觀、真實、完整地評估其有效性和安全性，還要追蹤長期安全性和子代安全性。我國已經對干細胞臨床研究發布了政策文件，有望通過強化管理，規范干細胞治療的臨床研究。